索坦對腎透明細胞癌786-0細胞生長與Tiam1表達的影響*

孟慶澤，喬保平，宮璀璀，劉德海，張喜卿

1)鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科鄭州450052 2)中國人民解放軍153中心醫院泌尿外科鄭州450042 3)中國人民解放軍153中心醫院中心實驗室鄭州450042 4)中國人民解放軍153中心醫院病理科鄭州450042

腎癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，轉移是惡性腫瘤治療失敗和患者死亡的主要原因，盡管近年來各種治療方法不斷改進和完善，但轉移性腎癌患者的預后仍然較差。因此，仍需進一步尋找和開發新的用于治療腎癌的方法和分子靶點。Tiam1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1)是近年來發現的一種原癌基因，研究［1］發現Tiam1通過Tiam1-Ras信號通路調控腫瘤細胞的侵襲和轉移，該通路的異常與多種惡性腫瘤密切相關。索坦能抑制多個受體酪氨酸激酶，降低血小板源生長因子受體、血管內皮細胞生長因子、干細胞因子受體等活性，進而抑制腫瘤生長，阻止病理性血管形成和腫瘤轉移［2］。作者應用不同濃度的索坦干擾腎透明細胞癌株786-0，采用MTT和TUNEL法檢測各組腎癌細胞凋亡和存活情況，采用免疫細胞化學和原位雜交技術檢測各組腎癌細胞中Tiam1蛋白和mRNA表達情況，探討索坦對腎透明細胞癌細胞Tiam1生長和表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細胞 索坦購自美國輝瑞公司;Trizol試劑購自Invitrogen公司;DNAaseⅠ購自上海生工生物工程有限公司;5-溴4-氯3-吲哚磷酸/硝基藍四唑鹽(BCIP/NBT)購自Promega公司;鼠抗人Tiam1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;即用型免疫組化廣譜試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。腎透明細胞癌細胞786-0為鄭州大學醫學院重點實驗室保存。

1.2 細胞培養與分組 應用含體積分數10% 胎牛血清的DMEM培養基培養細胞，置于36.5℃、體積分數5%CO2培養箱內，取生長狀態良好的細胞用于實驗。每孔2×107個細胞接種于96孔板中，每組設3個復孔，將處于對數生長期的786-0細胞分成4組:索坦低濃度處理(A)組、索坦中濃度處理(B)組、索坦高濃度處理(C)組、正常對照(D)組。細胞鋪板后24 h，A、B和C組分別加入索坦2、4和8 μmol/L，D組加常規DMEM培養液，分別培養24、48、72 h。

1.3 Tiam1蛋白的檢測 采用免疫細胞化學方法。40 g/L多聚甲醛固定的細胞標本經體積分數0.3%TritionX-100/PBS透化后，加正常羊血清封閉，Tiam1一抗按照1∶100稀釋，4℃溫度孵育過夜。PBS洗后，置37℃孵育1.5 h，DAB顯色，伊紅復染。陰性對照實驗用PBS代替一抗。Tiam1蛋白陽性染色表現為黃色或棕色顆粒，以細胞質中表達為主。①染色強度:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。②染色范圍:隨機選擇5個高倍視野(×400)，陽性細胞百分比≤10%為0分，～25%為1分，～50%為2分，＞50%為3分。①×②為最后得分［3］。

1.4 Tiam1 mRNA的檢測 采用原位雜交法。待細胞生長狀態良好、鋪滿瓶壁后，用冰預冷的PBS洗2遍，參照說明書，用Trizol試劑常規提取細胞總RNA，總RNA用DNaseⅠ消化去除殘存的基因組DNA。PBS液取代一抗作陰性對照。結果判定:Tiam1 mRNA原位雜交陽性信號呈藍紫色，位于胞質內。光鏡下每張隨機選取10個高倍視野，按陽性細胞數所占百分比及著色深淺進行結果判定［4］。①按陽性細胞百分比計分:＜1%為0分，1% ～為1分，26% ～為2分，51% ～為3分，≥76%為4分。②按著色深淺計分:無著色為0分，淡藍色為1分，藍色為2分，藍紫色為3分。①×②為最后得分。

1.5 細胞存活率的檢測 各組細胞培養48 h后，MTT法測細胞存活率，每組3個復孔。每孔加20 μL MTT，繼續培養4 h。棄去上清液，加DMSO 200 μL/孔，振蕩，充分溶解。在酶標儀490 nm波長處讀取吸光度(A)值。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.6 細胞凋亡率的檢測 采用TUNEL法。取各組培養48 h細胞，用40 g/L多聚甲醛固定制備的滴片，5 μg/L蛋白酶K 37℃消化10 min。每片加末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)緩沖液18 μL，Bio-Dutp及TdT各1 μL，4℃過夜。加親和素-堿性磷酸酶(SAALP)37 ℃，20 min孵育后，Tris-HCl pH 7.5洗3次，pH 9.5洗2次，BCIP/NBT底物顯色，熒光復染。陰性對照用TdT緩沖液代替TdT。顯微鏡下觀察，凋亡細胞核和(或)細胞質呈棕褐色，細胞核無著色為陰性。凋亡指數(apoptosis index，AI)的計算方法:每張計數200個細胞，重復3次，AI=(凋亡細胞數/200)×100%。

1.7 統計學處理 采用 SAS 9.1.3進行分析。同一時間點各組細胞和同組細胞不同時間點Tiam1蛋白和mRNA表達，以及各組細胞存活和AI的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 各組細胞Tiam1蛋白及mRNA的表達 見圖1、2 和表1。

表1 各組細胞Tiam1蛋白及mRNA的表達(n=3)

2.2 各組細胞存活率及AI結果 見表2。

表2 各組細胞存活率和AI %

3 討論

Tiam1是從小鼠T淋巴瘤細胞中分離鑒定出來的促腫瘤轉移基因，位于第2l號染色體的 q22.1帶，具有 DH、PH 等許多重要的功能域［5］。研究［6-8］發現，Tiam1在多種腫瘤組織及細胞中均有表達。Minard等［9］對11種乳癌細胞株的研究結果表明，Tiam1蛋白表達水平越高，細胞遷移和轉移的能力越強。劉莉等［10］認為Tiam1與結直腸癌的轉移顯著相關。前期研究中作者發現腎透明細胞癌組織中Tiam1表達增強，且與腫瘤侵襲轉移有關。作者應用不同濃度的索坦干擾腎透明細胞癌株786-0，結果顯示:不同濃度的索坦處理24、48、72 h后，各組細胞Tiam1蛋白及mRNA的表達均較正常對照組下降，且隨著索坦濃度增加，細胞Tiam1蛋白及mRNA的表達減弱;同一濃度處理組中，隨著時間延長，Tiam1蛋白及mRNA的表達降低。另外，培養48 h隨索坦濃度增加，細胞存活率降低，凋亡率增加。

綜上所述，索坦可抑制腎癌細胞的生長，誘導細胞的凋亡，可抑制腎癌786-0細胞中Tiam1蛋白及mRNA的表達。由此作者認為Tiam1在腎癌侵襲、轉移過程中可能起到重要的作用，索坦可通過抑制Tiam1蛋白表達來抑制癌細胞生長。

［1］Bouquier N，Vignal E，Charrasse S，et al.A cell active chemical GEF inhibitor selectively targets the Trio/RhoG/Rac1 signaling pathway［J］.Chem Biol，2009，16(6):657

［2］Motzer RJ，Michaelson MD，Redman BG，et al.Activity of SU11248，a multitargeted inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor and platelet-derived growth factor re-ceptor，in patients with metastatic renal cell carcinoma［J］.J Clin Oncol，2006，24(1):16

［3］鐘天平，彭秋平，邊志衡，等.結腸癌組織中Tiam1的表達與淋巴管生成之間的關系［J］.中華腫瘤防治雜志，2007，14(8):604

［4］Ding Y，Chen B，Wang S，et al.Overexpression of Tiam1 in hepatocellular carcinomas predicts poor prognosis of HCC patients［J］.Int J Cancer，2009，124(3):653

［5］Habets GG，Scholtes EH，Zuydgeest D，et al.Identification of an invasion-inducing gene，Tiam-l，that encodes a protein with homology to GDP-GTP exchangers for Rho-like proteins［J］.Cell，1994，77(4):537

［6］Liu L，Wang S，Zhang Q，et al.Identification of potential genes/proteins regulated by Tiam1 in colorectal cancer by microarray analysis and proteome analysis［J］.Cell Biol Int，2008，32(10):1215

［7］Stebel A，Brachetti C，Kunkel M，et al.Progression of breast tumors is accompanied by a decrease in expression of the Rho guanine exchange factor Tiam1［J］.Oncol Rep，2009，21(1):217

［8］Qi Y，Huang B，Yu L，et al.Prognostic value of Tiam1 and Rac1 overexpression in nasopharyngeal carcinoma［J］.ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec，2009，71(3):163

［9］Minard ME，Kim LS，Price JE，et al.The role of the guanine nucleotide exchange factor Tiam1 in cellular migration，invasion，adhesion and tumor progression［J］.Breast Cancer Res Treat，2004，84(1):21

［10］劉莉，許岸高，楊玉芳，等.Tiam1對結直腸癌細胞生物學特性的影響［J］.中華病理學雜志，2005，34(10):664