5-氟尿嘧啶對胰腺癌細胞sw1990增殖及相關基因表達的影響

朱春暉，謝 勇，呂農華#

1)南昌大學醫學院研究生部南昌330006 2)南昌大學第一附屬醫院消化研究所南昌330006

抗代謝藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種在腫瘤治療中經常使用的化療藥物，其本身是無活性的，在細胞內轉化為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸(5-fluoro-2-deoxyuridine 5-monophosphate，5-FdUMP)等活性代謝產物［1］，在 RNA 和 DNA 代謝中發揮作用［2-4］。作者觀察了5-FU對胰腺癌sw1990細胞增殖及相關基因表達的影響，探討5-FU抗腫瘤作用的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌sw1990細胞株由上海第二軍醫大學長海醫院屠振興教授惠贈。主要試劑:5-FU(上海旭東海普藥業有限公司)、Trizol、M-MLV、dNTP、OligodT(15)、RNasin(Promega公司);無核酶水;Mastermix(Tiangen);石蠟油;無水乙醇;異丙醇;氯仿;總蛋白提取試劑盒(北京普利萊公司);各種抗體(Santa Cruz公司);熒光試劑盒(Pierce公司);DMEM(Gibco公司);胎牛血清 (杭州四季青公司);瓊脂糖 (Amresco公司);其余試劑為國產分析純。

1.2 實驗分組 按6×3析因設計進行實驗分組。因素1 為 5-FU 劑量，包括 0、50、100、200、400 和 800 mg/L共6個水平。因素2為作用時間，包括24、48和72 h 3個水平。使用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液，于37℃、體積分數5%CO2培養箱中，按上述實驗條件對sw1990細胞分組進行孵育培養，0.5 g/L胰酶消化貼壁生長的細胞進行傳代［5］。

1.3 觀測指標

1.3.1 細胞增殖抑制率檢測 采用MTT法檢測。胰酶消化后收集細胞，每組細胞以104個/孔接種于96孔培養板中。細胞覆蓋率達70% ～80%后吸出培養基。每孔加入MTT溶液(5 g/L溶于PBS)20 μL，37℃孵育4 h。吸棄上清液，每孔加DMSO 150 μL振蕩10 min，使藍色結晶充分溶解，于酶聯免疫檢測儀上在490 nm波長處測定吸光度(A)，計算細胞增殖抑制率。抑制率=(對照孔A－實驗孔A)/(對照孔A－空白孔A)×100%。

1.3.2 p53、bax及 pten mRNA 檢測 采用 RT-PCR法。分別收集各組細胞，按 Trizol試劑盒說明提取總RNA，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳可見5S、18S、28S共3個條帶，RNA樣品經紫外分光光度儀測定，A(260 nm)/A(280 nm)比值在 1.8 ～2.0，適用于下一步實驗，適用于下一步實驗。RT-PCR按Promega試劑盒說明操作。引物序列及反應條件見表1。PCR產物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，用Bandscan圖像分析軟件進行吸光度積分值分析，以目的基因與內參照β-actin條帶吸光度積分值之比作為目的基因mRNA的相對表達量。

表1 引物序列、反應條件及產物大小

1.3.3 P53、BAX、PTEN 及磷酸化 AKT(p-AKT)蛋白檢測 采用Western blot法。分別收集各組細胞，蛋白提取及定量參照文獻［5］。樣品經凝膠電泳分離，電轉移后膜封閉1 h，加入封閉液稀釋的一抗(1∶200)，結合2 h，加封閉液稀釋的二抗 (1∶1 000)，反應1.5 h。以β-actin為參照。ECL顯色，X線膠片曝光，顯影、定影，拍照保存，讀取各條帶A值，以目的蛋白與β-actin條帶的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0進行數據處理5-FU作用時間和劑量對sw1990細胞增殖抑制率及凋亡相關基因mRNA表達的作用采用析因設計的方差分析進行評價，采用t或t’檢驗比較5-FU處理及未處理對sw1990細胞相關蛋白表達的影響，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制率測定結果 見表2。可以看出，各劑量5-FU作用后sw1990細胞增殖抑制率隨作用時間延長均有所增大。

表2 不同劑量5-FU作用不同時間后sw1990細胞增殖抑制率測定結果(n=6)%

2.2 p53、bax、pten mRNA 檢測結果 見圖1～3和表3～5。

圖1 不同劑量5-FU作用24(左)、48(右)及72 h(右)后sw1990細胞p53 mRNA的表達

表3 不同劑量5-FU作用不同時間后sw1990細胞p53 mRNA的表達(n=6)

圖2 不同劑量5-FU作用24(左)、48(中)及72 h(右)后sw1990細胞bax mRNA的表達

表4 不同劑量5-FU作用不同時間后sw1990細胞bax mRNA的表達(n=6)

圖3 不同劑量5-FU作用24(左)、48(中)及72 h(右)后sw1990細胞pten mRNA的表達

表5 不同劑量5-FU作用不同時間后sw1990細胞pten mRNA的表達(n=6)

2.3P53、BAX、PTEN 及 p-AKT 蛋白檢測結果MTT分析及RT-PCR檢測結果顯示，5-FU作用后sw1990細胞增殖明顯受到抑制，但隨著5-FU劑量的增高和作用時間的延長，雖然增殖抑制作用更加明顯，但是凋亡相關基因的mRNA表達無明顯增高，因此，綜合考慮藥物對細胞的毒性作用，選擇50 mg/L 5-FU作用24 h為實驗條件進行相關蛋白的檢測。結果見圖4和表6。

圖4 50 mg/L 5-FU作用24 h后sw1990細胞P53、BAX、PTEN和p-AKT蛋白的表達

表6 P53、BAX、PTEN及p-AKT蛋白檢測結果

3 討論

抗代謝藥物5-FU是一種在腫瘤治療中經常使用的化療藥物，自從40年前Heidelberger首次合成以來一直是治療實體腫瘤最有效的抗腫瘤藥物。該研究結果顯示，5-FU能顯著抑制胰腺癌sw1990細胞的增殖，這種抑制作用具有劑量依賴性，并隨作用時間的延長而有所增強。一般情況，細胞通過線粒體介導通路和膜死亡受體介導通路來調控凋亡。該研究結果表明，5-FU作用后sw1990細胞p53、bax、pten mRNA及相應蛋白表達上調。5-FU作用后通過誘導p53 ser42磷酸化，從而上調P53AIP1的表達，促進p53轉錄，增高P53蛋白水平［6］;同時，低濃度5-FU能誘導諸如rRNA生物合成斷裂的核糖體應激，將核糖體蛋白從細胞核中解離出來，與MDM2結合，解除 MDM2對 p53的抑制，同時也能通過ATM和c-Abl激酶誘導MDM2的磷酸化，并抑制p53降解［7-8］。p53表達上調后可促 p21waf1/cip1、bax、puma等的表達，下調p-AKT蛋白的表達，觸發了級聯的下游事件，包括線粒體膜電位的崩潰，凋亡基因的線粒體蛋白細胞色素C(Cytc)和SMAC的釋放，線粒體膜發生改變，Cytc及凋亡誘導因子(AIF)等釋放入胞質，與胞質中的凋亡活化因子結合，繼而活化 caspase-3、6、8 和9［9］及包括 FasL［10］和 fas相關的死亡結構域蛋白［11］在內的促凋亡基因，裂解大量底物(包括抗凋亡成分及結構蛋白等)。與此同時，5-FU誘導p53表達后能促進caspase-3和Bid的活化，并通過與Bcl-2蛋白家族有關的信號通路增加其誘導凋亡的能力［12］，最終通過線粒體介導通路和膜死亡受體介導通路發揮細胞增殖抑制及凋亡促進作用。

Klampfer等［13］研究表明致癌的 Ras信號能在體內促進5-FU作用后p53的積聚及其在絲氨酸15的磷酸化，從而促進凋亡而非生長停滯［13］。眾所周知，胰腺癌細胞中Ras過表達，這是否在5-FU對胰腺癌細胞的p53誘導中發揮作用還有待進一步研究。

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