玻璃化冷凍法對(duì)凍融胚胎移植周期結(jié)局的影響

婁 華，孫麗君，王興玲，郝大勇，王雪梅，于曉娜

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心鄭州450052

隨著體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，胚胎冷凍技術(shù)已在人類輔助生殖領(lǐng)域占據(jù)了重要的地位。新鮮周期移植后剩余的可利用胚胎、為預(yù)防卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生以及促排卵過程中因內(nèi)分泌或內(nèi)膜異常而取消新鮮周期移植進(jìn)行全胚冷凍，均對(duì)冷凍胚胎復(fù)蘇后臨床妊娠率和冷凍安全性提出了更高的要求。鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心自2008年8月開展玻璃化冷凍技術(shù)冷凍人卵裂期胚胎，取得了較好的效果。該研究總結(jié)了470個(gè)復(fù)蘇周期的臨床結(jié)果，對(duì)玻璃化冷凍和傳統(tǒng)的程序化慢速冷凍2種方法的復(fù)蘇情況進(jìn)行了比較。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2008年8月至2010年6月因不孕不育在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院行IVF-ET或卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的患者，于取卵后第3天對(duì)移植后剩余的可利用胚胎進(jìn)行冷凍，所有患者均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)。共470個(gè)周期，其中玻璃化法冷凍胚胎324個(gè)周期(玻璃化組，共216例患者)，程序化慢速冷凍胚胎146個(gè)周期(程序化組，共92例患者)。

1.2 胚胎冷凍及復(fù)蘇

1.2.1 凍存胚胎的選擇 采用長(zhǎng)方案或短方案促排卵，適時(shí)注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)，36～37 h后取卵，根據(jù)患者情況采用常規(guī)IVF或ICSI，取卵后第3天胚胎分級(jí):Ⅰ級(jí)，細(xì)胞大小相對(duì)均勻，形狀規(guī)則或碎片≤5%卵裂球面積;Ⅱ級(jí)，細(xì)胞大小稍不均勻，形態(tài)略不規(guī)則或5%≤碎片≤20%;Ⅲ級(jí)，細(xì)胞大小明顯不均勻，形態(tài)明顯不規(guī)則或20%≤碎片≤50%;Ⅳ級(jí)，停止發(fā)育，細(xì)胞大小嚴(yán)重不均或碎片＞50%。評(píng)分Ⅰ～Ⅲ級(jí)的胚胎為可利用胚胎。

1.2.2 冷凍及復(fù)蘇方法 ①玻璃化冷凍法:應(yīng)用Medicult玻璃化冷凍復(fù)蘇試劑盒，試劑從冰箱內(nèi)取出后室溫下平衡20 min，將1～3個(gè)胚胎放入1 mL含較低濃度的乙二醇(EG)和丙二醇(PROH)平衡液中3～10 min，可看到胚胎先皺縮后恢復(fù)原狀。將胚胎移入0.5 mL含較高濃度的EG和 PROH的冷凍保護(hù)液吹打不低于3次，用吸管將胚胎一次性放到冷凍載體(cryotop)上，迅速投入液氮并裝麥管，在冷凍保護(hù)液中時(shí)間應(yīng)不超過1 min。整個(gè)過程在室溫下進(jìn)行。復(fù)蘇時(shí)將載體從液氮中取出，迅速置入平衡好的復(fù)蘇液中1 min，將胚胎轉(zhuǎn)移至稀釋液1、稀釋液2及稀釋液3中各3 min后，再移至平衡液3 min，最后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中清洗，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。②程序化慢速冷凍法:室溫下將胚胎轉(zhuǎn)移至含體積分?jǐn)?shù)5%甘油的冷凍液(1 mL)中平衡10 min，然后移至含體積分?jǐn)?shù)9%甘油和0.2 mol/L蔗糖的冷凍液(1 mL)中平衡10 min后吸入麥管，每管1～3個(gè)胚胎，將麥管放入程序冷凍儀，以2℃/min的速率從25℃降溫至-6℃，再浸泡10 min后以0.3℃/min的速率降溫至-35℃后取出麥管浸入液氮。復(fù)蘇時(shí)取出麥管，在空氣中緩慢晃動(dòng)30 s后，將麥管放入30℃水浴箱內(nèi)30 s，取出麥管并剪斷，將胚胎吹入含0.5 mol/L蔗糖的解凍液(1 mL)中10 min，再移至含0.2 mol/L蔗糖的解凍液(1 mL)中10 min，最后移入培養(yǎng)液中清洗，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

解凍后的胚胎有3種情況:全部卵裂球完整，部分卵裂球完整，所有卵裂球損傷死亡。以解凍后胚胎存活的卵裂球數(shù)≥50%總細(xì)胞數(shù)作為胚胎復(fù)蘇存活的標(biāo)準(zhǔn)。將解凍后存活的胚胎1～3個(gè)培養(yǎng)2 h后移植。

1.3 胚胎移植內(nèi)膜準(zhǔn)備方案及移植時(shí)機(jī)選擇

1.3.1 自然周期 對(duì)月經(jīng)規(guī)律、既往排卵正常的患者，月經(jīng)第10天開始行B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，根據(jù)B超監(jiān)測(cè)結(jié)合血黃體生成素(LH)、雌激素(E2)水平確定排卵時(shí)間，自排卵日給予黃體酮40 mg肌內(nèi)注射，1次/d，排卵后2～3 d移植凍融胚胎。

1.3.2 激素替代周期 對(duì)于排卵不規(guī)律、月經(jīng)不規(guī)則的患者，口服戊酸雌二醇遞增或恒量法，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，給予黃體酮40 mg肌內(nèi)注射，1次/d，共2 d，黃體酮量加量至60 mg并維持該劑量。注射黃體酮3 d后移植胚胎。

1.4 妊娠診斷標(biāo)準(zhǔn) 胚胎移植后14 d監(jiān)測(cè)血總HCG≥30 IU/L，為生化妊娠;胚胎移植35 d后B超提示妊娠囊或流產(chǎn)物中可見絨毛為臨床妊娠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。2組患者年齡、不孕時(shí)間、移植日內(nèi)膜厚度、胚胎分級(jí)、孕周、新生兒體質(zhì)量及身高等的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，2組患者周期取消率、胚胎復(fù)蘇率、胚胎完整率、臨床妊娠率、胚胎種植率、流產(chǎn)率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組患者一般情況比較 見表1。

表1 2組患者一般情況比較

2.2 2組患者胚胎復(fù)蘇情況及妊娠情況比較 玻璃化組復(fù)蘇324個(gè)周期，因胚胎死亡取消移植周期11個(gè)，共解凍877個(gè)胚胎，存活801個(gè)胚胎，移植793個(gè)胚胎;程序化組復(fù)蘇146個(gè)周期，取消移植周期5個(gè)，共解凍427個(gè)胚胎，存活326個(gè)胚胎，移植313個(gè)胚胎。見表2。

表2 2組患者胚胎復(fù)蘇情況及妊娠情況比較 %

2.3 2組患者分娩及新生兒情況比較 玻璃化組已分娩39例，其中雙胎10例，單胎29例，共分娩新生兒49例;尚有65例處于繼續(xù)妊娠中。程序化組已分娩30例，其中雙胎2例，單胎28例，共分娩新生兒32例，其余4例仍在妊娠中。2組患者孕周、新生兒體質(zhì)量及身高比較無差異，均未發(fā)現(xiàn)有遺傳表型異常。見表3。

表3 2組患者分娩及新生兒情況比較

3 討論

與新鮮胚胎相比，冷凍胚胎的臨床妊娠率及胚胎種植率均較低，因?yàn)樵谂咛ダ鋬鲞^程中，可能會(huì)發(fā)生多種冷凍損傷，其中冰晶的形成是造成冷凍損傷的最主要因素。長(zhǎng)期以來，人們一直應(yīng)用程序化慢速冷凍技術(shù)進(jìn)行人類胚胎的冷凍保存，程序冷凍采用緩慢降溫的方式進(jìn)行冷凍，降溫的過程通常需要2 h。但較長(zhǎng)的降溫過程難以杜絕冰晶造成的冷凍損傷，雖然復(fù)蘇后大部分胚胎可存活，但其完整性往往遭到破壞。1998年 Mukaida等［1］首次獲得玻璃化凍融人類卵裂期胚胎妊娠及分娩成功。近年來，許多學(xué)者［2-3］相繼開展了玻璃化冷凍卵母細(xì)胞、卵裂期胚胎及囊胚的研究，并取得了可喜的成績(jī)。玻璃化冷凍是指在數(shù)分鐘內(nèi)將細(xì)胞固化為完全的玻璃態(tài)，可避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成對(duì)胚胎的機(jī)械性損傷，從而使胚胎復(fù)蘇率及胚胎完整率明顯提高。鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心自2008年8月開展玻璃化冷凍人卵裂期胚胎后獲得了較好的復(fù)蘇效果。

研究結(jié)果顯示:玻璃化組胚胎存活率、完整率及臨床妊娠率均高于程序化組，與Rezazadeh等［4］研究結(jié)果一致。凍融后全部卵裂球存活表明胚胎有良好的發(fā)育潛力，部分卵裂球損傷或死亡可能會(huì)影響胚胎的孵出和植入。劉浩等［5］研究發(fā)現(xiàn):卵裂球受損程度與妊娠率和胚胎種植率呈負(fù)相關(guān)，受損率越高，妊娠率和胚胎種植率越低。Rienzi等［6］主張移植前通過顯微操作技術(shù)去除壞死卵裂球可顯著提高冷凍胚胎的臨床妊娠率及種植率，提示復(fù)蘇胚胎中壞死的細(xì)胞可能影響存活細(xì)胞的發(fā)育，從而影響臨床妊娠率。而玻璃化冷凍復(fù)蘇胚胎完整率達(dá)83.24%，較高的胚胎完整率可能是其優(yōu)于程序化慢速冷凍技術(shù)的關(guān)鍵。

盡管玻璃化冷凍技術(shù)在胚胎冷凍保存方面有以上諸多優(yōu)勢(shì)，但其冷凍人類胚胎、配子的歷史畢竟僅十余年，其安全性一直受到關(guān)注。玻璃化冷凍需采用高濃度的冷凍保護(hù)劑，冷凍保護(hù)劑選擇的核心問題在于盡可能降低對(duì)胚胎的毒性作用，又要考慮其形成玻璃化的能力。有學(xué)者［1］認(rèn)為單獨(dú)用一種冷凍保護(hù)劑EG的毒性最小，但常需較高的濃度。而聯(lián)合應(yīng)用PROH可彌補(bǔ)EG玻璃化形成能力差的問題，并降低其濃度。該研究使用的玻璃化冷凍保護(hù)液是商品化制品，主要成分是EG、PROH和蔗糖，采用低濃度的EG和PROH作為平衡液使胚胎有一定的冷凍保護(hù)劑負(fù)荷，縮短了胚胎在高濃度玻璃化冷凍液中的時(shí)間。為避免冷凍保護(hù)劑對(duì)胚胎的損傷及毒性作用，該研究采用的cryotop法冷卻速率可達(dá)-23 000℃/min，在冷凍操作時(shí)嚴(yán)格控制玻璃化冷凍保護(hù)液與胚胎接觸的總時(shí)間在60 s內(nèi)。Cryotop載體屬于開放式載體，使胚胎直接和液氮接觸達(dá)到快速降溫的目的，但具有潛在微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。為避免開放式載體可能引起的感染性疾病以及長(zhǎng)期暴露在玻璃化冷凍液對(duì)胚胎的損傷，作者嘗試開展采用封閉性載體進(jìn)行玻璃化冷凍，因樣本量少，尚需進(jìn)一步研究。

該研究對(duì)玻璃化冷凍復(fù)蘇后分娩的49例新生兒進(jìn)行隨訪，均身體健康，無畸形兒出生。玻璃化組流產(chǎn)率與程序化組比較無差異，其孕周、新生兒出生體質(zhì)量及身高均與程序化組無差異，與Wennerholm等［7］的研究結(jié)果一致。目前文獻(xiàn)報(bào)道的最大樣本是Takahashi等［8］對(duì)采用玻璃化冷凍復(fù)蘇后分娩的252個(gè)新生兒進(jìn)行隨訪的研究，尚未發(fā)現(xiàn)有遺傳表型異常者，認(rèn)為玻璃化冷凍保存胚胎是較安全的。但與程序化慢速冷凍已在臨床上廣泛應(yīng)用二十余年、并有大量的隨訪數(shù)據(jù)提示其安全性的結(jié)果相比，玻璃化冷凍的產(chǎn)科和新生兒數(shù)據(jù)有限，還需今后深入研究對(duì)子代的影響。

［1］Mukaida T，Wada S，Takahashi K，et al.Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions for 8-cell mouse embryos［J］.Hum Reprod，1998，13(10):2874

［2］Zhu D，Zhang J，Cao S，et al.Vitrified-warmed blastocyst transfer cycles yield higher pregnancy and implantation rates compared with fresh blastocyst transfer cycles:time for a new embryo transfer strategy［J］.Fertil Steril，2011，95(5):1691

［3］宋文妍，孫瑩璞，金海霞，等.睪丸取精失敗周期中冷凍卵子與新鮮卵子妊娠結(jié)局的比較［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，45(4):651

［4］Rezazadeh VM，Eftekhari P，Karimian L，et al.Vitrification versus slow freezing gives excellent survival，post warming embryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos［J］.J Assist Reprod Genet，2009，26(6):347

［5］劉浩，金志魁，耿春惠，等.卵裂球受損對(duì)凍融胚胎移植周期臨床結(jié)局的影響［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2007，16(1):12

［6］Rienzi L，Ubaldi F，Iacobelli M，et al.Developmental potential of fully intact and partially damaged cryopreserved embryos after laser-assisted removal of necrotic blastomeres and post-thaw culture selection［J］.Fertil Steril，2005，84(4):888

［7］Wennerholm UB，S?derstr?m-Anttile V，Bergh C，et al.Children born after cryopreservation of embryos or oocytes:a systematic review of outcome data［J］.Hum Reprod，2009，24(9):2158

［8］Takahashi K，Mukaida T，Goto T，et al.Perinatal outcome of blastocyst transfer with vitrification using cryoloop:a 4-year follow-up study［J］.Fertil Steril，2005，84(1):88