機動車尾氣有機提取物對HepG2細胞的遺傳毒性

郭海玲，夏向群，楊海燕

1)北京中醫藥大學東直門醫院護理部北京100700 2)河南省疾病預防控制中心環境衛生科鄭州450016 3)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室鄭州450001

隨著經濟的發展，城市機動車數量呈直線增長，機動車排放的尾氣已成為現今空氣污染的主要來源。研究［1］表明機動車尾氣中含有大量的致突變和(或)致癌作用的化學物質，如多環芳烴等。動物實驗［2］結果顯示機動車顆粒物有機提取物經大鼠皮膚染毒能引起致癌效應。由此引發人們對機動車尾氣致癌作用的廣泛研究［3-5］。雙核細胞微核試驗和彗星試驗是廣泛應用于化學物遺傳毒性篩檢的測試方法，但關于機動車尾氣對體外培養的HepG2細胞雙核微核(cytokinesis-block micronucleus，CBMN)和彗星尾距的影響目前國內還未見報道。為此，作者應用CBMN試驗和彗星試驗探討機動車尾氣對HepG2細胞的體外遺傳毒性，為進一步在機動車尾氣暴露人群開展遺傳生物監測提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 機動車尾氣有機提取物準備 選某公交客車(燃燒汽油)于怠速狀態下，用中流量空氣采樣器收集汽車尾氣顆粒物，流量為10 L/min，顆粒物經玻璃纖維濾膜阻留，采樣30 min。濾膜經干燥、恒重后保存。取采集了機動車尾氣顆粒物的玻璃纖維濾膜，切除相當于30 mg顆粒物的濾膜，剪成小塊，置于具塞三角燒杯中，分數次加入150 mL二氯甲烷(CH2Cl2)，用250 mA的超聲波提取3次，40 min/次。過濾提取液，合并于蒸發皿中，45℃水浴揮發至干，用二甲基亞砜(DMSO)溶解成含顆粒物30 g/L的提取物，低溫保存備用。

1.2 細胞株 人肝癌HepG2細胞(購于協和醫科大學基礎研究所細胞中心)貼壁生長于含體積分數10%小牛血清的DMEM培養基中，在體積分數5%CO2培養箱中37℃下常規傳代培養。

1.3 汽車尾氣有機提取物細胞毒性測定［6］HepG2細胞接種于96孔板，密度為1×105mL－1，每孔100 μL;培養24 h后，加入不同質量濃度有機提取物(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 和 80.0 mg/L)，作用24 h，每組設6個平行孔。溶劑對照組加體積分數0.1%DMSO，空白組只加培養液、MTT和DMSO。用MTT法測定各組HepG2細胞存活率。染毒結束后，輕輕吸棄上清液，每孔加入100 L MTT(0.5 g/L)，繼續培養4 h后，輕輕吸棄上清液，每孔加入150 L DMSO，于搖床上低速搖蕩10 min，使紫色結晶完全溶解，用酶標儀以490 nm波長測定吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組A值－空白組A值)/(對照組A值－空白組A值)。

1.4 CBMN試驗［7］細胞傳代后，接種至6孔板，密度為5×104mL－1，每孔2 mL。培養24 h后，吸棄上清液。每孔加入2 mL不同質量濃度有機提取物(2.5、5.0 和 10.0 mg/L)，每組各設 6 個平行孔。同時設溶劑對照組(體積分數0.1%DMSO)及陽性對照組(博萊霉素，2 mg/L)。24 h后棄去培養液，PBS洗滌3次，加入新鮮的含體積分數10%胎牛血清的完全培養基，同時加入細胞松弛素B，終濃度為3 mg/L，繼續培養1.5個細胞周期。作用結束后，胰蛋白酶消化后離心收集細胞。0.075 mol/L KCl低滲，體積比3∶1的甲醇、冰醋酸固定后滴片。將玻片置于室溫下自然干燥過夜。使用體積分數10%Gimsa染液染色10 min，于1 000倍鏡下計數1 000個雙核細胞中的微核數。每組分析6張片子。

1.5 彗星試驗［8-9］細胞傳代后，接種至6孔板，密度為5×104mL－1，每孔2 mL。培養24 h后，吸棄上清液。每孔加入2 mL不同質量濃度有機提取物(2.5、5.0 和 10.0 mg/L)，每組設 6 個平行孔。同時設溶劑對照組及陽性對照組(同1.4)。染毒24 h后棄去培養液，PBS洗滌3次，胰蛋白酶消化后離心收集細胞。常規制片、裂解、解旋、電泳、中和及脫水、染色和分析，使用國產彗星試驗圖像分析軟件IMI 1.0分析照片，每孔測量50個細胞［9］。以Olive尾矩作為DNA損傷指標進行分析。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0進行分析，應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較各組間微核率和Olive尾矩的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 機動車尾氣有機提取物對HepG2細胞毒性作用 結果見圖1。可以看出，在低劑量范圍內(2.5、5.0和10.0 mg/L)，有機提取物對HepG2未表現出細胞毒性，但隨著劑量的升高，細胞存活率降低。在后續的CBMN試驗和彗星試驗中機動車尾氣有機提取物的最高作用質量濃度選擇10.0 mg/L。

圖1 不同質量濃度的機動車尾氣有機提取物對HepG2細胞存活率的影響

2.2 機動車尾氣有機提取物對HepG2細胞微核率和Olive尾矩的影響 結果見表1。

表1 機動車尾氣有機提取物對HepG2細胞雙核細胞微核率及Olive尾矩的影響

3 討論

微核是指細胞經歷了一個有絲分裂周期后遺留在胞質中的染色體斷片或整條染色體。1985年Fe-nech在傳統微核方法的基礎上首先建立了CBMN試驗方法。與傳統細胞微核試驗方法比較，CBMN僅計數分裂一次細胞的微核數，解決了由于個體間細胞動力學不同所致的結果差異，提高了方法的準確性［10］。而且人類微核計劃實施后，制定了標準化的實驗方法，并闡明了年齡、性別等因素對一般人群基線微核率的影響。該方法成熟簡便，涂片保存容易，且可被多人重復分析。因此CBMN試驗方法被廣泛應用于環境化學污染物質遺傳毒性篩檢。

該研究結果顯示機動車尾氣有機提取物對HepG2細胞具有明顯的遺傳毒性作用，5.0和10.0 mg/L有機提取物組微核率高于溶劑對照組。機動車尾氣中含有大量的致突變/致癌物如多環芳烴及其類似物，苯并(a)芘是其中重要的一種，能引起微核率升高，該實驗中有機提取物引起的HepG2細胞微核率升高可能因為機動車尾氣中含有大量的苯并(a)芘，但這種推測尚需對所采集的機動車尾氣的組成成分進一步分析加以驗證。

彗星試驗是檢測單個細胞DNA鏈斷裂應用最廣泛的技術，其指標可以作為DNA損傷的生物標志。Olive尾矩則是綜合反映細胞DNA損傷程度的一個指標，既與彗星長度呈正相關，又與細胞尾部DNA百分比呈正相關。該研究結果表明，機動車尾氣有機提取物各劑量組細胞Olive尾矩明顯高于溶劑對照組。說明機動車尾氣有機提取物能夠引起體外培養的HepG2細胞DNA鏈發生斷裂。Zhang等［11］研究發現，汽油汽車尾氣可誘導 A549細胞DNA損傷，在彗星試驗中細胞拖尾率及DNA遷移長度均隨尾氣濃度的增加而增加。Xu等［12］報道與陰性對照組比較，機動車尾氣微顆粒物可引起A549細胞拖尾率及尾長度明顯增加。該研究結果和上述報道一致，在不同組織來源的細胞系中得到了相似的結果。

作者還發現，2.5 mg/L機動車尾氣有機提取物可引起HepG2細胞Olive尾矩明顯升高，并使微核率明顯升高，提示彗星試驗在檢測機動車尾氣引起的遺傳損傷時可能比CBMN試驗敏感。推測可能由于彗星試驗是在去除處理因素后收集細胞進行試驗，此時細胞還沒有足夠時間進行DNA損傷修復，檢出的是初級的未經修復的DNA損傷，而CBMN試驗檢出的是細胞經歷一個細胞周期后固定下來的突變，在此過程中細胞可能啟動了修復機制，對低劑量引起的DNA損傷進行了部分修復，所以在經歷一個細胞周期后，輕微的損傷完全修復后不再形成微核［13-14］。

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