南疆不同品種綿羊MSTN基因克隆及其組織表達譜分析

尹闊 任述強 徐國江 李樹偉* 劉勝梅

在 1807 年，CulleyG［1］在《Observations on livestock》上描述了肌生成抑制素(Myostatin，MSTN)基因缺失所致的雙肌表型(double－muscling)的牛。1997年，McPherron AC等［2］在研究轉化生長因子(Transforming growth factor－β，TGF－β)超家族時，發現了生長/分化因子－8(Growth/Differentiation fator，GDF－8)，之后將其命名為肌生成抑制素。MSTN是一種分泌型多肽，由前體蛋白質、信號肽編碼前肽的N－端區和編碼成熟肽C－端區三部分組成，能夠對肌肉生長起負調控作用。MSTN基因結構和功能的揭示使得畜禽業和醫學研究有了新的發展。Thomas M等［3］對小型豬研究表明，小型豬與其它肌肉量大的豬相比，其MSTN表達量高。李樹偉等［4］將豬肌生成抑制素成熟蛋白編碼序列在真核細胞中表達成功。A lexandra C等［5］通過分析肥胖小鼠中的肌肉生長抑制素基因突變對脂肪積累的影響，發現它的脂肪聚積可被抑制70%。在含有肌肉生長抑制素突變的刺鼠中，異常的葡萄糖代謝也被部分抑制。在對小鼠和大鼠的研究中表明［6～8］，MSTN 基因在小鼠胚胎肌細胞中的作用主要是調節了增殖和分化的平衡;在小鼠乳腺上皮細胞中的表達，其主要是和上皮細胞作用，并且與乳腺的分化成負相關;對無負重肌肉萎縮大鼠經10天跑臺訓練后研究顯示，MSTN mRNA表達和蛋白水平明顯降低，與運動促進骨骼肌的再生密切相關。由此可見，MSTN基因在動物的生長和調控中起著重要作用，因此在豬、牛、羊、雞、鴨等畜禽品種中把MSTN基因作為生產性狀的重要基因進行研究。

和田羊、卡拉庫爾羊是新疆南疆重要的綿羊品種之一，其羊毛制品、羔皮制品和羊肉為新疆南疆經濟增長和人們生活水平提高有著重要作用。目前和田羊、卡拉庫爾羊在飼料營養、雜交、生化指標［9］和遺傳方面做過相關報道，而在MSTN基因克隆和表達譜分析方面還尚未見報道。本實驗通過RTPCR技術對MSTN基因表達譜進行研究，并為今后的進一步研究奠定基礎，以期在畜牧業上有很好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

試驗樣本采自和田羊山區型、和田羊平原型和卡拉庫爾羊的心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、腿肌肉組織，各品種綿羊分別由和田地區策勒縣、洛浦縣和塔里木大學動科院實驗站提供。采集后迅速置于液氮中保存。

1.1.2 儀器與試劑

PCR儀(美國BIO－RAD);電泳儀(美國BIORAD);凝膠成像分析儀(美國BIO－RAD);IKA分散機 T18 basic(德國IKA);BioPhotometer(德國eppendorf);低溫高速冷凍離心機(德國SIGMA);Trizol購自 Invitrogen公司;TAKARA Reverse Tran-SCriptase M－MLv(RNaseH－)和分子量標準DL－2，000均購自大連TaKaRa公司;引物合成在上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 綿羊各組織總RNA提取

用Trizol法提取和田羊和卡拉庫爾羊組織樣總RNA，具體操作參照試劑盒說明書進行。提取的總RNA用無RNase dH2O溶解，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用BioPhotometer對所抽提總RNA樣品進行吸光度檢測，樣品檢測值A260/280均在1.8±0.1之間。提取的樣品于－70℃保存備用。

1.2.2 MSTN 基因引物設計

參照GenBank中已發表的綿羊MSTN基因cDNA 序列(GenBank登錄號:NM_001009428.1)，結合Primer5.0的設計和 Oligo6.0評價，設計 cDNA引物，為避免非特異性擴增，將引物的退火溫度設計的稍高(66℃)，以β－actin作為內參，將模板濃度調整一致。上游引物序列為006F:CCA TGG ATG GAT TTT GGG CTT GAT TGT GAT GAG，下游引物序列為006R:CTC GAG TTA TCA TGA GCA CCC ACA GCG ATC TAC TAC

1.2.3 總RNA的反轉錄

取總RNA 1μL，加 Oligo(dT)12－18 Primer 1μL，無RNase dH2O 到6μL，70℃保溫10 min后迅速在冰上急冷2 min以上，離心數秒使模板RNA的變性溶液聚集于離心管底部，加5×M－MLV Buffer 2 μL，dNTPs(各10 mM)0.5 μl，RNase inhibitor(40 U/μl)0.25 μl，RTaseM － MLV(RNase H － )(200 U/μl)0.5 μl，補無 RNase dH2O 至 10 μl，混勻，42℃保溫1 h，70℃保溫15 min后冰上冷卻。PCR 反應:10 × PCR buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，MgCl23 μl，Taq 酶 0.1 μl，006F 0.5 μl，006R 0.5 μl，cDNA 2μl。循環程序為:94 ℃預變性11 min;94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72℃延伸10 min。

2 結果

2.1 綿羊各組織中總RNA提取

如圖1所示，用 Trizol法提取綿羊各組織總RNA，運用1%的瓊脂糖凝膠電泳對總RNA進行檢測。

2.2 PCR 擴增

2.2.1 卡拉庫爾羊PCR結果

利用006引物和β－actin對卡拉庫爾羊心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、肌肉進行PCR擴增，于2%瓊脂糖凝膠中的電泳結果如圖2(A)和(B)，結果顯示，在肝臟、腎臟、脾臟、肌肉中有MSTN C端110個氨基酸編碼序列的PCR擴增產物，擴增產物長度約370 bp。其他組織中未見表達。

2.2.2 和田羊平原型PCR結果

利用006引物和β－actin對和田羊平原型心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、肌肉進行PCR擴增，于2%瓊脂糖凝膠中的電泳結果如圖3(C)和(D)，結果顯示，在心臟、腎臟、脾臟、肌肉中有MSTN C端110個氨基酸編碼序列的PCR擴增產物，擴增產物長度約370 bp。在其他組織中未見表達。

2.2.3 和田羊山區型PCR結果

利用006引物和β－actin對和田羊(山區型)心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、肌肉進行PCR擴增，產物在2%瓊脂糖凝膠中的電泳結果如圖4(E)和4(F)，結果顯示，在心臟、腎臟、脾臟、肌肉中有MSTN C端110個氨基酸編碼序列的PCR擴增產物，擴增產物長度約370 bp。在其他組織中未見表達。

3 討論

從1997年McPherron AC等［1］發現轉化生長因子(Transforming growth factor－β，TGF－β)超家族新成員——生長/分化因子 －8(Growth/Differentiation fator，GDF－8)后，國內外研究人員又對大鼠、豬、人、火雞、雞、狒狒、綿羊、山羊、牛、馬、斑馬魚等動物的MSTN基因進行了結構、功能、表達機制、生理作用等方面的研究，發現并非是動物的所有組織中都能表達肌肉生成抑制素，而且在骨骼肌中表達量也隨時間不同而有變化。

本研究根據GenBank上登錄的綿羊的MSTN基因序列，設計引物，成功克隆了綿羊的MSTN C端110氨基酸編碼序列。研究顯示，MSTN基因在綿羊的肌肉中均有表達與文獻報道的結果一致。在山區型、平原型和田羊的肝臟中無表達，而在卡拉庫爾羊的肝臟中有表達。歐陽紅生［10］、［11］研究小組擴增了大約克夏豬MSTN基因的全部序列6015bp，包括兩個內含子和三個外顯子，克隆了MSTN基因的cDNA測出了MSTN基因的編碼序列，并采用了RTPCR擴增法研究了MSTN基因在豬骨骼肌、心肌、肝、腎、肺、脾、胰、脂肪組織中的表達情況。結果發現MSTN基因僅在骨骼肌、心肌組織中表達。Ji S等［12］測定了生長發育期豬的各組織后發現MSTN mRNA基因主要分布于骨骼肌中，在其他組織如:脂肪組織、腦、舌、心、肺、脾、小腸、腎、肝和骨髓也有少量的分布，而且該研究還表明MSTN在乳腺中也有表達。Kubota K等［13］在雞胚的腦、眼、胃、骨骼肌、心臟、小腸、大腸、腎、睪丸、卵巢中均檢測到MSTN基因的表達，但是肝臟中沒有表達。MSTN在不同物種間表達各不相同，可以推測MSTN在機體中的作用是多方面的。

Sharma等［14］發現在羊和牛心臟的浦肯野氏纖維和心肌細胞中也有MSTN基因mRNA的表達，實驗表明，當心肌梗塞時，在受損部位周圍的心肌細胞肌抑素表達上調，推測肌抑素在心肌發育和生理過程中期起重要作用。Rodgers等［15］分離了羅非魚(Oreochromis mossambicus)和白狼鱸(Morone chrysops)的骨骼肌MSTN cDNA序列。結果表明:MSTN在羅非魚中的表達不僅僅局限于骨骼肌，在多種組織如眼、鰓絲、腸、大腦、性腺中都有表達。而且，羅非魚幼苗MSTN表達的時序性與肌形成一致。這些結果表明，在羅非魚中(其他魚類也有可能)，MSTN的生理作用不僅僅局限于抑制肌細胞的生長，還有可能影響細胞類型和器官系統的分化。Kim等［16］研究了MSTN在3T3－L1脂肪前體細胞的分化中的作用。他們的數據表明，在3T3－L1細胞中MSTN抑制脂肪前體細胞的分化，它被介導或部分被C/EBPα和PPARγ輪流調控。說明MSTN在脂肪細胞發育中也有作用。而本研究中MSTN基因在和田羊和卡拉庫爾羊在心肌、肺臟、腎臟、脾臟中各有異同，說明MSTN基因除了在骨骼肌中抑制肌肉的生成外，在機體中還可能參與脂類代謝、糖代謝、呼吸、泌尿、免疫以及細胞類型和器官系統分化，Steven L等［17］曾專門以“Gatekeepers of organ growth”為題發表評論，說明MSTN在器官生長中的作用。

綜上所述，MSTN基因除抑制骨骼肌生成外，對維持機體正常的生理平衡有重要作用.找到一種能夠可調控地阻斷MSTN蛋白功能，又不影響機體其它生理功能的技術手段成為MSTN基因在畜牧業應用上所面臨的問題。

4 結論

山區型和田羊、平原型和田羊、卡拉庫爾羊的MSTN基因在肌肉、腎臟、脾臟中都有表達，與文獻報道一致?？梢奙STN除了在骨骼肌中的作用外，還可初步推測MSTN基因在器官組織中有一定作用。山區型、平原型和田羊MSTN基因在心肌中有一定表達，而在卡拉庫爾羊在心肌中幾乎無表達，還需要進一步的研究分析是物種原因還是MSTN表達時序性所致。MSTN在山區型、平原型和田羊的肝臟中幾乎無表達，而在卡拉庫爾羊中則有一定量表達。MSTN在山區型和田羊、平原型和田羊與卡拉庫爾羊的肺臟中則都無表達。根據實驗和文獻資料分析，對MSTN基因在各組織中進行更深入的研究，將揭示MSTN基因更多生理功能。

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