基于牙釉質基因巢式PCR性別鑒定超微量DNA檢測方法的建立

唐紀偉 高慶華

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)是一種體外擴增DNA片段的技術。自PCR技術問世以來，以其快速、準確、敏感和簡便等優點在醫學、微生物學和胚胎移植前遺傳學診斷(PGD)等領域得到了廣泛的應用［1－3］。現在，PCR技術已被廣泛應用于牛、羊等動物的胚胎性別鑒定，還建立了許多基于PCR技術的家畜胚胎性別鑒定方法。隨著研究的進一步深入，要求PCR性別鑒別技術在原有基礎上更加快速、敏感和簡捷。巢式PCR法是在PCR技術的基礎上發展起來的，它是根據一個性別特異基因設計一對外引物以得到被測基因較長的擴增產物，再根據擴增產物序列設計第二對引物(內引物)對產物進行第二次擴增。巢式PCR經過兩次擴增，使擴增產物的量增加，結果更容易判斷，同時巢式引物的使用增加了擴增產物的特異性，提高了準確度［4］。

本實驗采用巢式PCR擴增超微量山羊血液基因組DNA進行性別鑒定，旨在建立超微量DNA檢測方法，在對家畜早期胚胎進行鑒定時，盡可能少的切取胚胎，以減少對胚胎的傷害，提高胚胎移植的成功率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2×HSTMTaq mix(廣東東盛公司)、TaKaRa DL－2000 DNA marker、瓊脂糖(大連寶生物公司);AB2400型PCR儀、DYCP－31BM型水平電泳槽(北京六一儀器廠)、JY－ECPT3000型穩壓穩流電泳儀、凝膠成像儀;血液樣品(采自阿克蘇地區當地山羊)。

1.2 引物設計

根據羊AMEL基因序列，采用BLAST和Clustal W程序設計巢式引物，巢式外引物(amelF1:5'－CATGGT GCCAGCTCAGCAG －3'和 amelR1:5'－CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC－3')，巢式內引物(amelF2:5'－CAGCAACCAATGATGCCAGTTC－3'和amelR2:5'－GTCTTGTCTGTTGCTGGCCA －3')，兩對引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 DNA提取、稀釋及PCR擴增

1.3.1 血液基因組DNA的提取

山羊血液樣品用消化緩沖液(10 mmol/L Tris－ HCl(pH 8.0)，10 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，2%SDS)和蛋白酶 K(終濃度 0.5 mg/mL)55℃消化過夜后，加入等體積Tris飽和酚，溫和顛倒混勻10 min，10000 r/min離心10 min，寬口徑吸管吸取上層水相，轉移至新EP管中;加入等量酚、氯仿、異戊醇(體積比25:24:1)混合液，按上述方法各抽提一次;加入2倍體積預冷的無水乙醇、1/10體積的NaAc(pH 5.2)，來回顛倒沉淀DNA;基因組DNA析出后，棄上層液體，用70%乙醇洗滌兩次;留少量乙醇，自然揮發至快干時，加入滅菌三蒸水使DNA完全溶解，分裝并保存于－20℃冰箱中。

1.3.2 DNA樣品濃度的測定和稀釋

取基因組DNA 20μL，用滅菌超純水稀釋到2000μL，以滅菌超純水作空白對照，應用CRAY100紫外分光光度計RNA－DNA估算3.0軟件包測定其濃度后，將樣本梯度稀釋至 10 ng/μL、1ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL。

1.3.3 PCR 反應

血液DNA巢式PCR擴增模板第一輪PCR擴增，其中 Taq mix(含 50 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris－ HCl、3 mmol/L MgSO4、400 mmol/L dNTPs、0.1U/μLTaq DNA 聚合酶、溴酚藍等)10μL，10 μmol/L的上下游巢式外引物各0.8μL，1μL模板(10 ng)，8.2 μL滅菌超純水(共20 μL);預變性94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環;最后72℃ 延伸5 min。第二輪PCR擴增，其中Taq mix 5μL、上下游巢式內引物引物各0.4 μmol/L，取 1μL第一次 PCR產物作模板(共10μL)，循環參數為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，62℃30 s，72℃ 30 s，共 30個循環;最后 72℃ 延伸5 min。

超微量模板第一輪 PCR擴增，其中 Taq mix 4μL，10μmol/L的上下游巢式外引物各0.15μL，1μL模板(10 pg)，14.8 μL滅菌超純水(共20μL);預變性 94℃ 5 min;94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共25個循環;最后 72℃ 延伸5 min。第二輪PCR反應其中4μL Taq mix、10μmol/L的上下游巢式內引物各0.4μL，取4.6μL第一次PCR產物作模板(共10μL)，循環參數為:94℃ 5 min;94℃30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 個循環;最后72℃延伸5 min。

1.4 凝膠電泳分析

取5μL PCR擴增產物點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠(含 0.05 μg/mL EB)，電壓 75 V，電泳時間30 min，紫外透射儀觀察擴增結果，PCR擴增產物中出現兩條帶者判定為雄性，出現一條帶者判定為雌性，在全自動數碼成像及分析系統上拍照。

2 結果

采用巢式PCR對血液基因組DNA擴增后雌性山羊只得到一條帶，雄性山羊得到兩條帶(圖1);對圖1中顯示經過第二次擴增后的PCR產物量遠遠高于只經過一輪擴增的PCR產物量，陰性對照的結果顯示，從樣品采集到PCR擴增的整個實驗過程中沒有發生DNA污染。巢式PCR的敏感性比一次PCR高100倍以上，本實驗根據連續10倍梯度稀釋法研究的結果，用巢式PCR法擴增10 pg量的基因組DNA仍能得到預期的陽性結果(圖2)。

圖2 10 pg量山羊基因組DNA AMEL基因片段巢式引物的擴增性別鑒定

3 討論

AMEL 基因同時存在于牛［5］、羊［6］、豬［7］和人［8］中X 和Y 染色體上(AMELX，AMELY)，根據其同源區長度在兩條性染色體上的不同，只需設計一對引物就能擴增出不同長度的基因片段。雌性基因組DNA的PCR產物經過電泳檢驗得到對應X染色體的一條非特異性條帶，而雄性基因組的PCR產物可以得到兩條帶，分別對應X染色體的非特異性條帶和 Y 染色體的特異性條帶［9］。Michael等［10］的試驗證明PCR鑒定可精確到單個細胞，陳從英等［11］對牛的胚胎細胞進行擴增，靈敏度可達10個細胞。本實驗通過擴增山羊AMEL基因鑒定性別的方法對巢式PCR反應的敏感性進行了檢測，通過連續梯度稀釋法(10－2μg/μL、10－3μg/μL，10－4μg/μL，10－5μg/μL)檢測的結果，可以對 10 pg量的山羊基因組DNA(約3個細胞)進行擴增。通過實驗證實巢式PCR比一次PCR反應的敏感性高100倍以上［1］。由于PCR反應的高靈敏性，極易受到污染，影響鑒定結果。因此應該認真對待每一步操作，盡可能避免污染因素對鑒定結果的影響。圖1的陰性對照的結果顯示，實驗中從樣品采集到PCR擴增的整個實驗過程中沒有發生DNA污染。

本實驗是在對胚胎進行性別鑒定之前所做的預試驗。在胚胎移植前對胚胎取樣進行性別鑒定時，如果從胚胎取樣的細胞數少，PCR靈敏度不夠，擴增產物少，鑒定結果不好判斷;而如果從胚胎取樣的細胞數過多，對胚胎的傷害大，影響其妊娠率。因此，在對胚胎進行切割取樣時只需數個細胞就能得到準確的結果，降低了對胚胎的傷害，可以提高移植的成功率，為后期對山羊早期胚胎進行性別鑒定奠定了基礎。另外，利用PCR技術還可以提高對家畜致病菌的檢測［12］。

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［11］ 陳從英，黃路生，陳靜波，等.牛早期胚胎性別鑒定PCR反應體系的優化研究［J］.畜牧獸醫學報，2003.(3):209－212.

［12］ 顧海洋，左文斌，賀艷艷等.高致病性藍耳病毒與低致病性藍耳病毒RT－PCR檢測方法［J］.塔里木大學學報，2011，23(1):20 －24.