非腎臟沉積性高尿酸血癥大鼠腎臟模型的建立及評價

史為伍,吳紅赤,彭 艷,邱慧磊

(1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院腎內科,黑龍江 哈爾濱 150001;2.佳木斯大學附屬第一醫院腎內科,黑龍江 佳木斯 154003)

隨著飲食結構及生活行為的改變,高尿酸血癥的發病率呈上升趨勢。我國普通人群中高尿酸血癥患病率約為10%,痛風患病率約為0.84%[1]。傳統觀念認為,高尿酸血癥腎臟損傷是因為尿酸鹽在腎臟的沉積,引發的局部刺激引起的。目前,臨床上無癥狀高尿酸血癥十分常見,潛在危險性也很大,近年來研究發現,高尿酸血癥的大鼠腎臟內未出現沉積時,已經出現了明顯的腎小球肥大、硬化和纖維化等[2]。因此,我們假設非沉積性高尿酸血癥,即雖然出現高尿酸血癥,但并未在腎臟出現沉積,也會對腎臟造成損傷。目前國內對此方面的研究未見報道。

為研究非沉積性高尿酸血癥是否會對腎臟造成損傷,我們建立非沉積性高尿酸血癥大鼠腎臟模型。本實驗采用單獨應用尿酸酶抑制劑(氧嗪酸),參考文獻[2]選取不同劑量,觀測血尿酸、腎功、尿蛋白變化,并采用 PAS及 De Galantha氏染色[3]腎臟形態學及尿酸鹽沉積情況進行研究。其中 De Galantha氏染色為尿酸鹽結晶的特異顯色法,染色后腎組織呈黃色,而尿酸鹽結晶呈黑色團塊。探討使用尿酸酶抑制劑制備非沉積性高尿酸血癥大鼠腎臟模型的最佳劑量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性雄性 Wistar大鼠(由哈爾濱醫科大學附屬第一醫院實驗動物中心提供),體重:180～ 220g,動物自由攝取食物與水。

1.2 藥品、試劑及儀器

氧嗪酸(齊河城匯精細化工有限公司);腺嘌呤 (上海藍季科技發展有限公司);全自動生化分析儀。光學顯微鏡。

1.3 動物分組與處理

將大鼠隨機分為7組(每組7只),即正常對照組、5個氧嗪酸組(見表1)及沉積組。其中模型組分別以氧嗪酸鉀 550mg/kg、 650mg/kg、 750mg/kg、 850mg/kg及 950mg/kg,溶于 2mL生理鹽水中,每日一次灌胃。對照組給予生理鹽水2mL每日一次灌胃;沉積組[4]給予腺嘌呤100mg/kg+氧嗪酸 750mg/kg+生理鹽水2mL,每日一次灌胃。各組分別于5周采血,離心,取血清,全自動生化分析儀測血尿酸、血肌酐及尿素氮;并于水合氯醛腹腔麻醉下取腎組織,分別固定于卡諾氏固定液及無水酒精中,觀察組織學變化。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 一般狀態

沉積組大鼠毛色暗,精神萎靡,食欲差,且實驗過程中死亡一只,其他各組大鼠一般狀態良好,被毛有光澤、整齊,攝食、飲水情況良好,實驗過程中各組大鼠均無死亡。

2.2 實驗前后尿酸的變化

各組大鼠實驗前、后血尿酸濃度 (見表1),氧嗪酸＜750mg/kg的兩組造模后血尿酸水平與對照組及造模前比較,差異具有顯著性 (P ＜0.05);氧嗪酸≥ 750mg/kg的三個組造模后血尿酸水平與造模前及對照組相比,差異具有顯著性 (P＜0.01);沉積組與對照組相比,差異具有顯著性(P ＜ 0.01)。

表1 實驗前后血尿酸變化水平 ± s,μmol/L)

表1 實驗前后血尿酸變化水平 ± s,μmol/L)

注:*與造模前及對照組相比 P＜0.01,# 與造模前及對照組相比 P ＜0.05。

對照組 76.14± 2.8575.93± 5.46550mg/kg組 74.43± 4.4385± 4.86#650mg/kg組 75.71± 4.9293.43± 5.51#750mg/kg組 75.71± 4.37129.71± 4.61*850mg/kg組 74.14± 4.34134.57± 4.78*950mg/kg組 75.29± 4.75139.14± 4.69*沉積組 74.71± 4.37413.43± 15.59*

2.3 實驗后各組尿蛋白、尿素氮及血肌酐測定

5周后 ,測得的尿蛋白定量、血肌酐及尿素氮水平(見表2)。氧嗪酸 ＜750mg/kg的兩個組與對照組比較,差異無顯著性 (P＞ 0.05);沉積組及氧嗪酸≥750mg/kg組與對照組比較,尿蛋白定量、SCr及 BUN差異具有顯著性 (P＜0.01)。

表2 實驗后尿蛋白、血肌酐及尿素氮值 ±s)

表2 實驗后尿蛋白、血肌酐及尿素氮值 ±s)

#與對照組相比 P＞ 0.05,★與對照組相比 P＜0.01。

對照組 13.93± 1.6134.91± 5.146.73± 0.91550mg/kg組 16.04± 1.5337.03± 4.476.91± 0.64#650mg/kg組 17.53± 1.3739.46± 4.237.0± 0.51#750mg/kg組 32.84±4.83★ 77.99± 10.00★ 10.94± 0.86★850mg/kg組 37.8±2.77★ 81.49± 9.77★ 11.13± 1.02★950mg/kg組 41.29±3.30★ 84.31±10.05★ 11.37± 1.04★沉積組 76.6± 4.09★ 121.43± 13.01★ 13.25± 0.88★

2.4 病理學研究結果

正常對照組:腎小球結構正常,無系膜細胞增生,(見圖1-A)。氧嗪酸 ＜750mg/kg的兩個組:腎小球基本正常,無結構改變,無系膜細胞及基質的增生 (見圖 1-B、C)。氧嗪酸≥750mg/kg組:腎小球體積增大,可見系膜細胞增生等改變,(見圖1-D、E、F)。沉積組可見腎小管及間質內尿酸鹽沉積,腎小管堵塞,發生纖維化,腎小球硬化等 (見圖 1-G)。非沉積組與沉積組相比,腎臟內無黑色的團塊樣物質沉積(見圖 2-A、 B)。

3 討論

經典的高尿酸血癥所致的腎損害認為是尿酸鹽結晶沉積于腎臟 ,引起腎損傷。但近年來有文獻報道[5],輕度的癥狀高尿酸血癥可導致腎臟的損傷,但腎臟內并未發現尿酸鹽的沉積。為了探討非腎臟沉積性高尿酸血癥致腎損傷的情況,我們進行了“非腎臟沉積性高尿酸血癥大鼠腎臟模型”的制備,同時進行相應對照組“腎臟沉積性高尿酸血癥大鼠腎臟模型”的制備工作[6]。因大多數哺乳動物,如嚙齒類動物體內含有尿酸氧化酶,使尿酸分解生成尿囊素排出體外,難以形成高尿酸血癥,自從1965年 ,Fridovich I[7]發現尿酸酶抑制劑可以有效地提高血清中尿酸的水平,此后尿酸酶抑制劑被應用于嚙齒類高尿酸血癥的動物模型中。目前應用尿酸酶抑制劑造模的方法主要有:①大鼠飼以2%的氧嗪酸,持續7周,可出現輕度高尿酸血癥[5]。②大鼠飼喂氧嗪酸0.4g/d和尿酸0.6g/d,3～ 4周后,血尿酸持續性升高[8]。③次黃嘌呤與尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀(OAPS)單獨或配伍,一次性給藥,建立急性高尿酸模型[9]。④腺嘌呤與氧嗪酸鉀配伍制備尿酸鹽沉積模型[10],等等。

基于本實驗采用單獨應用尿酸氧化酶抑制劑,因無尿酸鹽前體及尿酸的補給,大鼠血清尿酸呈現輕度增高趨勢。我們選用精確劑量進行灌飼,避免了混入食物中所導致的個體攝入差異。參照國外文獻[11]并加以改進。我們選擇氧嗪酸550 mg/kg、 650mg/kg、 750mg/kg、850mg/kg及 950mg/kg進行研究。實驗結果顯示:各實驗組大鼠血尿酸水平均較對照組升高,且隨著氧嗪酸劑量增加血尿酸水平有隨之增加的趨勢;尿酸鹽沉積組血尿酸升高明顯,腎組織內可見黑色尿酸鹽結晶團塊;氧嗪酸 ＜750mg/kg的兩個組,未見明顯腎臟損傷;氧嗪酸≥750mg/kg的三個組,腎臟病理顯示腎小球輕度肥大,系膜細胞增殖,但損傷程度各組未見明顯差異;單獨應用氧嗪酸各組腎組織內均未見到尿酸鹽結晶。

結果提示,單獨應用氧嗪酸時,均能夠導致大鼠血尿酸水平升高,同時未見尿酸鹽在腎臟沉積,氧嗪酸750mg/kg,每日一次,連續五周灌飼,可以導致腎臟的損傷,腎臟出現腎小球輕度肥大、腎小動脈壁增厚、小動脈發生玻璃樣變性及系膜細胞增生等形態學改變,且血生化及尿蛋白定量均證實了非沉積性高尿酸血癥可導致腎臟的損傷,其機制未見明確報道。非沉積性高尿酸血癥腎臟模型制備是成功的,為將來腎臟損傷機制的研究奠定了基礎。

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