冬蟲夏草含藥血清誘導神經干細胞分化的研究

鄭衍芳,李艷君,趙 勇,李嘯紅,黃昕燕,王志群

(1.遵義醫學院珠海校區人體解剖與組織胚胎學教研室,廣東珠海 519041;2.佳木斯大學醫學院,黑龍江 佳木斯 154007)

N SCs是神經系統發育過程中特殊的細胞群,是能夠在適當的微環境中分化產生神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的一類多能干細胞。近年來,一些研究表明移植神經干細胞治療急、慢性脊髓損傷以及多種神經系統疾病具有廣闊的臨床應用前景。本實驗就冬蟲夏草在促進神經細胞向神經元方向分化的作用進行了初步的探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

體外培養神經干細胞所用動物新生24h內的 Wistar大鼠,灌胃取血清體重平均為200g的 Wistar大鼠均為佳木斯大學動物實驗中心提供。冬蟲夏草菌絲體購自杭州中美華東制藥有限公司。

1.2 冬蟲夏草含藥血清的制備

隨機選取體重約200g的 Wistar大鼠分四組,每組 8只,適應性喂養7d后,分別給予冬蟲夏草水提液 0.5g/kg˙d,0.75g/kg˙d,1g/kg˙d分兩次灌胃,對照組予以等量的生理鹽水灌胃。灌胃14d,第14天早灌胃1h后,將大鼠進行乙醚麻醉后,行內眥采血,分離血清 ,56℃水浴30min滅活 ,放-20℃冰箱凍存備用。

1.3 N SC的分離培養與傳代

(1)N SCs的原代培養:取新生 Wistar大鼠兩只在無菌條件下斷頭取腦,用彎頭鑷子取海馬組織,放入盛 Hank's液的培養皿,漂洗三次后,剪成大小約1mm3組織塊,加入胰酶消化成乳糜狀,10%胎牛血清0.5mL終止消化,200目過濾網過濾,取過濾液離心,棄上清液 ,加入適量完全培養液,用拋光的長頸吸管吹打成單細胞懸液 ,調整細胞為1× 105個 /mL,接種到含 EGF,bFGF,B27的 DMEM/F12培養基的培養瓶中,放入37°、5%CO2、濕度80%的 CO2培養箱中培養,每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況 ,每3d半量換液一次,7d左右進行細胞傳代培養。

(2)NSCs的傳代培養:原代培養7d后,低倍鏡下觀察,細胞鋪瓶率達到80%～ 90%,克隆球直徑約為200μm時進行分瓶傳代。在無菌操作下用拋光的長頸吸管將克隆球連同培養液一同移入離心管,放入離心機中以1000r/min的轉速離心5min,棄上清液,機械分離神經球為單細胞懸液,在倒置顯微鏡下計數臺盼藍染色后活細胞比例后,以5× 105個 /mL的密度分裝,傳代培養,每隔3d半量換液1次,隔7d傳代1次。

1.4 N SC的 Nestin鑒定

NSCs的 Nestin鑒定傳代三次后的神經球接種到含DMEM/F12培養基的24孔板上(板上涂布 0.01%多聚賴氨酸),24h內行 Nestin細胞免疫組化檢測。

1.5 N SC的誘導分化

將傳三代后的神經干細胞球分4組,每組8孔,以細胞為1× 105個 /mL的密度接種在賴氨酸包被的24孔板上 ,實驗組用 DMEM/F12培養液加10%低,中,高劑量的藥物血清,對照組用 DMEM/F12培養液加10%的鼠血清在37℃、5%CO2、80%的 CO2培養箱中培養。每隔3d半量換液,每天觀察細胞生長情況,培養7d進行 N SE、GFAP免疫細胞化學染色。

1.6 免疫組化

對藥物誘導7d的神經干細胞分別進行免疫細胞化學染色法 ,一抗 (Nestin1:400;NSE1:200;GFAP1:200)。NSE免疫細胞化學中,每孔蓋玻片隨機選取 10個不重疊視野,在100倍鏡下計數單位視野陽性細胞數通過計數陽性細胞率檢測神經干細胞向神經元分化情況。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1細胞培養觀察原代培養2h單細胞均勻懸浮在培養液中(圖1),7d可見肉眼可見較多的神經球聚集,液體透明。鏡下觀察,神經球比較多,背景干凈,球散在培養液中,球中央至外周均透明,折光度好,邊界清晰 (圖2)。

2.2 神經干細胞 Nestion免疫染色觀察

經免疫細胞化學染色,神經干細胞標記性蛋白 Nestin在原代及傳代培養的神經球均有表達(圖3),胞漿及突起呈黃褐色。將貼壁的神經球培養一周后,對分化的神經樣細胞分別進行 NSE(圖 4),GFAP(圖5)免疫組化,鑒定結果顯示陽性,神經元胞體近橢圓形,核較大、呈圓形 ,有一較長的突起,膠質細胞胞體多呈多角形或長梭形,核小 ,突起較多而短。從而驗證了培養的神經干細胞有增值分裂的特性。

2.3 冬蟲夏草含藥血清誘導 NSCs增殖分化的檢測結果

冬蟲夏草含藥血清添加到三代后的神經干細胞進行培養,24h內開始貼壁,克隆球的周緣開始有偽足形成,3d后突觸交織,神經樣細胞移出神經球,7d后,神經元細胞胞體逐漸增大,飽滿,突觸增長,神經元細胞分散移出 ,胞體飽滿 ,折光性好,突觸增長變粗 (NSE圖 6～ 9)。免疫組化顯示分化后NSE陽性細胞,與對照組相比冬蟲夏草含藥血清低,中濃度組分化 N SE細胞較多 (P＜0.01),而高濃度組細胞無明顯差異 (P＞ 0.05)。

表1 各實驗組誘導神經干細胞7d后神經元胞體周長及面積的測量 ±s,n=10)

表1 各實驗組誘導神經干細胞7d后神經元胞體周長及面積的測量 ±s,n=10)

a:P＜0.01;:bP＜0.01;c:P＞ 0.05。

組別 周長(um) 面積(um2)對照組 114.50± 6.79151.15± 18.82低濃度藥物血清組 145.71±5.17a 248.10±29.26a中濃度藥物血清組 142.23±6.54b 239.19±26.23b高濃度藥物血清組 118.91±6.54c 167.63±16.74c

3 討論

N SCs的特異性標志抗原是神經巢蛋白,或稱神經上皮干細胞蛋白(Nestin),該基因在未分化的神經系統中表達,分化后成熟的神經細胞不表達,因而是 NSCs的特異性標志物.研究的原代、傳代培養細胞,Nestin免疫組化呈陽性反應,具有神經干細胞的這一特征。神經干細胞最突出的兩個特點是具有自我更新能力,可通過不對稱細胞分裂產生新的細胞。本實驗利用 BrdU(溴脫氧尿苷),單抗標記技術,陽性表達細胞為 S期細胞或分裂增殖產生的新生細胞,表明本實驗分離培養的細胞群具有分裂增殖,自我更新的能力。動物灌服中藥后,提取血清用于體外實驗是日本學者 Hiriko Iwama首先提出的[1]。該方法更接近于體內實驗。一些研究[2～4]表明:NSCs自然分化為神經元的比例非常低。本實驗各試驗組促進神經干細胞分化為神經元的數量均高于對照組,且神經元樣細胞的面積、周長均大于對照組,這無疑是冬蟲夏草水溶液發揮的藥理作用。冬蟲夏草含有18種氨基酸,其中包括谷氨酸,甘氨酸,作為微環境中的一員也參與對神經干細胞分化的調節。從冬蟲夏草中分得腺嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、尿嘧啶、尿苷、脫氧腺苷和蟲草素(3'-去氧腺嘌呤核苷)等核苷類成分 ,尤以腺苷具有明顯的藥理作用[5]。可以調節腺苷酸環化酶活性。促進胞內 cAM P的增加,從而激活cAMP介導的信號轉導途徑,進而引起細胞的分化。實驗證明[6～8]各種糖蛋白、黏蛋白組成通過調節黏著和遷移能力,以及與細胞外基質中各種生長因子和細胞因子的結合,來影響 NSCs的增殖和分化。蟲草中的蟲草素和 D-甘露醇可以清除自由基[9],起到抗氧化的作用。近年的一系列研究表明,細胞內 ROS水平的輕微增高促進 NSCs的增殖和分化,而胞內 ROS水平的顯著增高則快速觸發 NSCS的凋亡。由此推斷,冬蟲夏草能通過上述幾個方面促進神經干細胞向神經元方向分化,并對所分化的神經元樣細胞有良好的促發育作用。由于血清成分復雜,冬蟲夏草的確切機制還有待進一步研究,但我們利用冬蟲夏草分化出較多的神經元細胞,這一結果為冬蟲夏草治療神經系統損傷性疾病提供了實驗依據,為臨床應用打下了理論基礎。

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