HPLC法測(cè)定人血漿中的拉莫三嗪

李 琪,雷力力,張志國(guó),汪鳳山

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科,黑龍江 佳木斯 154003)

拉莫三嗪(lamotrigine,LTG)為苯三嗪類的新一代廣譜抗癲癇藥。2005年在我國(guó)上市,拉莫三嗪(LTG)主要經(jīng)過(guò)肝臟代謝,LTG血藥濃度＞15mg/L時(shí),毒性反應(yīng)的幾率會(huì)增加;治療難治性癲癇時(shí),有效濃度在3～ 14mg/L;5～ 13mg/L時(shí),出現(xiàn)副反應(yīng)緩慢;13～ 14mg/L時(shí)副反應(yīng)發(fā)生幾率劇增。肝酶誘導(dǎo)劑如卡馬西平、苯妥英鈉可加速拉莫三嗪的代謝;肝酶抑制劑如丙戊酸鈉(V PA)可減緩拉莫三嗪的代謝。由于該藥與其它抗癲癇藥在藥動(dòng)學(xué)上存在的這種相互作用,導(dǎo)致了個(gè)體間的血藥濃度差異較大[1],因此在臨床中有必要對(duì)拉莫三嗪進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)[2～4],本文采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測(cè)定血漿中拉莫三嗪藥物濃度,以艾司唑侖為內(nèi)標(biāo)溶液,乙腈-磷酸緩沖液為流動(dòng)相,酸性條件下用乙酸乙酯作萃取劑,測(cè)定拉莫三嗪的血藥濃度,結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,可用于拉莫三嗪的血藥濃度監(jiān)測(cè)。

1 材料

1.1 儀器

大連依利特 P230Ⅱ高效液相色譜儀,UV230Ⅱ紫外-可見檢測(cè)器,EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站。XW-80渦旋混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司);AUW220D十萬(wàn)分之一分析天平(日本島津公司)。

1.2 試藥

____拉莫三嗪 (中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):100775-200401),艾司唑侖(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):1219-0102);甲醇、乙腈、乙酸乙酯為色譜純;磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜柱:Hypersil ODS2(250mm× 4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-0.05%磷酸 (36：64);流速:1.0mL˙min-1;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;進(jìn)樣量:20μL。在該色譜條件下,拉莫三嗪和艾司唑侖的保留時(shí)間分別為6.33min,9.29min,峰形良好。血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不影響拉莫三嗪的測(cè)定。色譜見圖 1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取拉莫三嗪對(duì)照品19mg,溶解于甲醇并定容至50mL,得拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取上述貯備液5mL,加甲醇至50mL,得 0.038 μg/mL的 LTG標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取艾司唑侖對(duì)照品24.8mg,溶解于甲醇并定容至100mL,得LTG標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取上述貯備液5mL,加甲醇至50mL,得0.0248mg/mL的艾司唑侖內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血樣處理

精密吸取健康人血漿200μL,置10mL玻璃試管內(nèi),加入0.0248mg/mL艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)液25μL,0.038mg/mL拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL,漩渦混勻,加乙酸乙酯4mL,旋渦混勻3min,3500r/mim離心10min,分取乙酸乙酯層 3mL于10mL試管內(nèi) ,于45℃下 N2氣流吹干 ,加 200μL甲醇溶解,作為樣品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取血漿200μL,加入不同濃度的拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL,配成濃度為 0.95、 1.9、 3.8、7.6、19、 38μg˙mL-1血樣 ,按“2.3”項(xiàng)下方法處理血樣,進(jìn)樣測(cè)定拉莫三嗪的峰面積,以拉莫三嗪濃度(X)對(duì)峰面積(Y)作線性回歸,得回歸方程為:Y=0.132x-0.0429(r= 0.9991,n=6)。結(jié)果表明 ,拉莫三嗪血藥濃度在0.95～ 38 μg˙mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。拉莫三嗪的定量限為 0.95μg˙mL-1。

2.5 精密度及回收率試驗(yàn)

按樣品溶液的制備方法,取拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液,稀釋為0.95、3.8、6.65 μg/mL三種濃度的樣品各 5份 ,按色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算回收率;另同法配制三種濃度樣品各1份,按色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)(同日不同時(shí)間進(jìn)樣5次 ,以及在三日內(nèi)進(jìn)樣5次),以樣品及內(nèi)標(biāo)峰面積比值計(jì)算日內(nèi)及日間精密度。加樣回收率及日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果 ±s,n=5)

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果 ±s,n=5)

對(duì)照品 加入量μ g˙mL-1 檢出量μ g˙mL-1 回收率(%) RSD% 日內(nèi) RSD% 日間 RSD%拉莫三嗪 0.950.9911±0.0225104.322.162.076.823.803.8872±0.0161102.291.571.974.416.656.6348±0.024199.772.421.353.04

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按樣品溶液制備方法制備樣品8份,按色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),測(cè)定拉莫三嗪的血藥濃度,含量的 RSD=1.89%,說(shuō)明本法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用空白血漿制備含拉莫三嗪 0.95、3.8、6.65μg/mL三種濃度的樣品 ,室溫放置 ,分別于 0h、 2h、4h、 8h、 16h、 24h、36h、48h取樣,按樣品溶液制備方法處理,并測(cè)定。24h內(nèi)的穩(wěn)定性的 RSD為 5.6%,24～ 48h內(nèi)穩(wěn)定性的 RSD為15.4%。說(shuō)明 24h較為穩(wěn)定,建議配置完成后在24h內(nèi)測(cè)定。

3 討論

國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道采用可以安定類藥物[5,6]作為內(nèi)標(biāo)物,艾司唑侖具有合適的保留時(shí)間 ,性質(zhì)穩(wěn)定,價(jià)格低廉,滿足作為內(nèi)標(biāo)物的要求。且艾司唑侖的峰位又不與內(nèi)源性物質(zhì)及拉莫三嗪的峰位重疊,故選擇艾司唑侖作為測(cè)定拉莫三嗪含量的內(nèi)標(biāo)物。本研究在190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)拉莫三嗪進(jìn)行紫外掃描 ,在 205、215、220、225、230、240nm 波長(zhǎng)處均有吸收峰,215nm波長(zhǎng)處拉莫三嗪有最大吸收峰,而在230nm波長(zhǎng)處,艾司唑侖峰形較好。為了兼顧艾司唑侖的含量測(cè)定。選用230nm波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定。在對(duì)萃取劑的選擇時(shí) ,正己烷、二氯甲烷等的效果均不是很好。采用乙酸乙酯直接提取血漿樣品,效果較好,操作簡(jiǎn)便,提取后樣品中雜質(zhì)較少。可以達(dá)到試驗(yàn)要求。流動(dòng)相的 PH值對(duì)峰形、峰位都有些影響,所以流動(dòng)相的選擇用乙腈-0.05%磷酸(36:64),加入磷酸緩沖液可以調(diào)整峰形,達(dá)到較好的分離效果。因此,采用 RP-HPLC法測(cè)定 LTG血藥濃度,操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、重復(fù)性好、回收率及精密度高,可用于拉莫三嗪的治療藥物監(jiān)測(cè)。

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