中藥薄層色譜影響因素分析及應用

李向軍，王 超，王 永，安軍永，王世華，李曉燕，秦 攏，王 猛

薄層色譜是中藥鑒別、中藥成方制劑質量標準主要的研究和控制手段之一，其研究質量對中藥成方制劑新藥項目的質量標準意義十分重要。薄層色譜鑒別在我國各版藥典中的應用增幅較大，如2005年版藥典共收載1 507項，2010年版藥典僅新增就達2 494項，且除礦物藥外均有專屬性強的薄層色譜鑒別方法。另外，中藥復方新藥研制的質量標準研究資料基本上采用了以對照藥材作對照的薄層色譜鑒別，說明薄層色譜技術在中藥分析與檢驗上占著重要的地位。雖然在制訂藥品標準時傾向于應用液相色譜技術，但薄層色譜因操作簡便、設備簡單、成本相對低廉、分離快速，在中藥鑒別領域仍被廣泛應用。

1 基本方法與原理

薄層色譜鑒別時，將樣品溶液用毛細管點于薄層板的一端，置密閉槽中，加入適宜溶劑作為流動相，由于毛細管原理，溶劑被吸上、沿板移動，并帶動樣品中各組分向前移動，這個過程稱為展開。由于各組分性質不同，移動距離不同，展開一定距離后，可得到互相分離的組分斑點。可用適當方法使各組分在板上顯示其位置，若組分本身有顏色，即可直接觀察，否則可噴顯色試劑或在紫外燈下觀察熒光等方法確定斑點位置。其分離原理是利用各成分對同一吸附劑的吸附能力不同，使在移動相(溶劑)流過固定相(吸附劑)的過程中，連續地產生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而使各成分互相分離。根據固定相不同，可以分為硅膠(G板、硅膠H板等)、聚酰胺、纖維素、離子交換劑、氧化鋁等薄層色譜。

2 影響因素及應對方案

2.1 溫度

一般情況下，溫度高，R f值也高。溫度主要影響有機溶劑的蒸發程度，影響展缸中各蒸氣的比例，從而改變了展開劑的比例[1]。要解決溫度對薄層色譜的影響，只能是控制展開時的溫度，如在冰箱或密封可控溫的裝置中進行展開試驗。

2.2 濕度

濕度可能主要影響薄層板的吸附能力，導致選擇性(容量因子)的變化。濕度應根據實際情況確定。為保持薄層色譜結果的重現性，可在展開缸的一端加入不同比例的硫酸?？刂茲穸人璧牧蛩峋唧w比例可參考表1。

表1 不同濕度所需的硫酸比例(V/V)

2.3 展缸和薄層板

展缸和薄層板是否飽和對生物堿類成分的薄層鑒別影響比較大。例如，苦參藥材薄層色譜鑒別時，展缸氨水飽和與未飽和后展開的色譜圖見圖1。可見，展缸和薄層板經飽和后展開的色譜圖斑點清晰、圓整，而未飽和展開的色譜圖斑點拖尾嚴重、邊緣效應較大。為此，筆者試驗了3種不同的展開條件:在展開劑中加入少量的氨水，在展開缸的另一端加入氨水，薄層板制備時加入0.1%的氫氧化鈉使薄層板為堿性。結果這3種方法均能達到飽和展缸和薄層板的目的，其色譜斑點清晰、圓整、分離良好。

圖1 展缸和薄層板是否飽和對薄層色譜的影響

2.4 樣品處理

中藥成分復雜，特別是中藥復方成分更是復雜多樣，不同成分之間相互干擾嚴重，難以得到滿意的分離效果，因此樣品處理對于中藥的薄層色譜鑒別至關重要。對于某些成分如皂苷類，經過多次分離純化處理后，薄層色譜斑點清晰、分離較好且背景較淺。圖2為某復方制劑樣品經不同方法處理后的薄層色譜圖。

圖2 樣品處理對薄層色譜的影響

2.5 其他因素

不同廠家的薄層板:不同廠家所用的硅膠粒度、性質，黏合劑和制作技術有所不同，都會導致色譜行為產生差異，手鋪板則更為明顯。因此，試驗時一定要做好詳細記錄，包括薄層板的類型、廠家、溫度、濕度等相關信息，以保證薄層色譜結果的重現性。

操作者的經驗和操作:新手操作的薄層色譜圖邊緣效應嚴重、斑點拖尾，而有經驗者操作的薄層色譜圖無邊緣效應、斑點無拖尾現象。說明在做薄層鑒別的過程中要不斷地試驗，總結經驗。

展開劑的使用次數:展開劑多次使用后，色譜斑點明顯減少，主要是由于展開劑的比例發生了變化。因此在做薄層展開時，展開劑要用新鮮的，不能重復使用。

3 操作注意事項

3.1 自制薄層板

黏合劑配制:常用的黏合劑為羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)，在溶解過程中，應將其少量地撒于水的表面，自然沉降、充分浸潤，溶脹之后可加熱溶解，若不急于使用則可直接浸泡至溶解。需要注意的是，黏合劑用前一定要過濾，所鋪的板子才會均勻。

鋪板:將黏合劑與固定相用的吸附劑按一定比例混合，向一個方向研磨，速度不宜快，要順著研缽的邊緣研磨并仔細觀察，一定要把氣泡排除，稠度以用研棒粘取呈連珠狀而不呈線狀下滴為好。研勻后，采用手鋪或者鋪板器鋪制薄層板。

干燥:鋪好后的板子要置于平面上晾干，否則難以保證板面硅膠的厚度均勻。用前再于105℃活化30 min。

3.2 展開

點樣:一般采用微升毛細管點樣，也可用自動點樣器。在薄層板點樣的斑點一般呈圓點狀或窄細的條帶狀;點樣基線距底邊15～20 mm，高效板一般為8～10 mm;圓點狀直徑一般不大于5 mm，高效板一般不大于3 mm;條帶狀寬度一般為5～10 mm，高效板一般為4～8 mm?？捎脤Ｓ冒胱詣踊蜃詣狱c樣器械噴霧法點樣，點間距離可視斑點擴散情況而定，以不影響檢出為宜，一般不少于8 mm，高效板不少于5 mm。

展開劑:展開劑要求新鮮配制，不要多次反復使用，若需分層，則應按要求放置分層后取所需的一相(上層或下層)備用。選擇展開劑的依據是溶劑的極性大小，極性大的化合物需用極性大的展開劑，極性小的化合物需用極性小的展開劑。在實際工作中，常用兩種或3種溶劑的混合物作展開劑，這樣更有利于調整展開劑的極性，以改善分離效果。R f值應在0.2～0.7范圍內。展開劑根據其極性大小可分為3種，弱極性溶劑體系的基本相由正己烷和水組成，再根據需要加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯來調節溶劑系統的極性，適用于生物堿、黃酮、萜類成分的分離;中等極性溶劑體系的基本相由氯仿和水組成，以甲醇、乙醇、乙酸乙酯等來調節極性，適用于蒽醌、香豆素以及一些極性較大的木脂素和萜類成分的分離;強極性溶劑體系由正丁醇和水組成，也是用甲醇、乙醇、乙酸乙酯等來調節，適用于極性很大的生物堿類成分的分離。

展開試驗:應使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴密的蓋子，底部應平整光滑，或有雙槽。上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸，展開時須能密閉。水平展開應用專用的水平展開缸。展開前如需溶劑蒸氣預平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉15～30 min，溶劑蒸氣預平衡后應迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，按照要求展開。

3.3 顯色

首先應根據被檢測的化學成分選擇合適的顯色劑。如果成分未知，可用硫酸進行顯色，因有機碳水化合物均可與稀硫酸進行氧化還原反應，按氧化的程度不同而顯不同的顏色或熒光;或可采用用鐵氰化鉀－三氯化鐵試劑對還原性物質顯藍色等。如果成分明確，可選擇專屬性較強的顏色反應顯色劑，如黃酮類選擇三氯化鋁乙醇溶液，氨基糖類選用對二甲氨基苯甲醛，醛酮類選用2，4－二硝基苯肼等。

3.4 結果檢視

復核檢驗:按照標準操作即可。常有兩種方法，日光下直接檢視或噴顯色劑后日光下檢視，如含有皂苷、三萜皂苷、生物堿類成分的藥材等;紫外光(254 nm或365 nm)下檢視或噴顯色劑后在紫外(254 nm或365 nm)下檢視，如含有香豆素類、蒽醌類、黃酮類成分的藥材等。

摸索試驗或預試驗:其結果檢視也有一定的技巧可循。一般檢視的順序為，先在日光或紫外光(254 nm和365 nm)下檢視;再噴以不破壞化學成分的顯色劑(如氨熏、碘熏等)，日光下檢視后，再于紫外光(254 nm或365 nm)下檢視;噴以可破壞化學成分的顯色劑(茚三酮試液、香草醛試液等)，日光下檢視后，再于紫外光(254 nm或365 nm)下檢視。這樣，一塊薄層板就可以得到9種不同條件下的色譜信息。這些大量的薄層斑點，多表示了性質不同的化學成分，雖有重疊，但在各自的檢視條件下卻互不干擾，呈現各自的斑點特征。如將當歸和川芎的樣品溶液分別點于同一塊薄層板上，展開后在紫外光燈(365 nm)下檢測均呈現共有的亮蘭色斑點;然后在紫外光燈(254 nm)下檢視，川芎比當歸多顯1個熒光熄滅斑點;再噴以三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視，當歸增加了另一個特征性熒光斑點;再噴以香草醛硫酸乙醇溶液后檢視，當歸比川芎又多一個棕褐色斑點(圖3)[2]。

圖3 當歸、川芎的檢視圖

4 應用

4.1 丹參

取本品粉末1 g，加乙醚5 mL，振搖，放置1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯－乙酸乙酯(19∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同的暗紅色斑點(圖4 A)[3]。

取本品粉末0.2 g，加75%甲醇25 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取丹酚酸B對照品，加75%甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯 －三氯甲烷 －乙酸乙酯 －甲醇 －甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點(圖 4 B)。

圖4 丹參薄層色譜圖

4.2 何首烏

取本品粉末0.25 g，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至3 mL，作為供試品溶液。另取何首烏對照藥材0.25 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各2μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上使成條狀，以苯－乙醇(2∶1)為展開劑，展至約 3.5 cm，取出，晾干，再以苯－乙醇(4∶1)為展開劑，展至約7 cm，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光條斑。再噴以磷鉬酸硫酸溶液(取磷鉬酸2 g，加水20 mL使溶解，再緩緩加入硫酸30 mL，搖勻)，稍加熱，立即置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的條斑(圖5)。

圖5 何首烏薄層色譜圖

4.3 決明子

取本品粉末1 g，加甲醇10 mL，浸漬1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，置水浴上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃素對照品、大黃酚對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各2μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同的橙色熒光斑點，置氨蒸氣中熏后斑點變為紅色(圖6)。

圖6 決明子薄層色譜圖

4.4 山楂

取本品粉末1 g，加乙酸乙酯4 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各4μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸(20∶4∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液(3→10)，在80℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同的紫紅色斑點;置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同的橙黃色熒光斑點(圖7)。

圖7 山楂薄層色譜圖

5 發展前景

薄層色譜設備簡單、操作方便、適用性廣，可以快速給出可靠、準確的結果等特點，一直被很多分析工作者所關注，并被用于多個領域。隨著科學技術的迅速發展，薄層色譜技術日新月異，已由傳統的普通薄層色譜發展到現在的高效薄層色譜、棒狀薄層色譜(TLC－FID)、加壓薄層色譜(OPLC)、離心薄層色譜(CTLC)、膠束薄層色譜(M－TLC)、包合薄層色譜(ICC)、二維薄層(2D TLC)、超薄層色譜(UTLC)等;而且，薄層色譜也與現代高科技的分析技術相結合，如薄層色譜－傅立葉變換紅外光譜聯用檢測、薄層色譜－拉曼光譜聯用檢測、薄層色譜－質譜聯用檢測、薄層色譜－核磁共振聯用檢測、薄層色譜－電化學方法聯用檢測等，使其成為一種靈敏、高效的分離與分析方法。今后，薄層色譜法仍將是可供選擇的經濟、可靠、快速的重要分析方法之一。

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典中藥材薄層色譜彩色圖集[M].廣州:廣東科學技術出版社，1993:10－16.

[2]韓桂茹，趙 韶，趙志軍.中藥全息薄層色譜鑒別研究 [J].中成藥，2009，31(1):5 －9.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，2005:52－53.