超高效液相色譜法檢測西紅花中非法添加的染料金橙Ⅱ

胡曉煒

金橙Ⅱ又名酸性橙Ⅱ、二號橙、桔黃橙、酸性金黃Ⅱ或酸性艷橙GR，俗名金黃粉，化學名為2－萘酚偶氮對苯磺酸鈉，是一種化工染料，主要用于皮革、紡織物染色，禁止作為食品添加劑使用。但其具有色澤鮮艷、著色穩定、價廉等特點，一些不法商販為了牟取暴利，將其用于藥材生產與加工，嚴重危害了消費者健康。西紅花又稱番紅花，是名貴的中藥材。為及時準確判斷西紅花中是否存在金橙Ⅱ，建立一套快速、準確的金橙Ⅱ檢測方法具有重要意義。筆者以金橙Ⅱ為指標成分，建立了定性定量測定西紅花中金橙Ⅱ的超高效液相色譜－串聯質譜(UPLC－MS/MS)法，可為西紅花的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

UPLC超高效液相色譜儀(Waters公司)。金橙Ⅱ(批號為20070520，上海萬坤化學試劑有限公司);乙腈(色譜純)，水(重蒸水)，醋酸銨(分析純);西紅花(市售品，編號分別為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 液相色譜條件

色譜柱:BEH C18柱(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm);柱溫:室溫(30℃);流動相:乙腈－0.01 mol/L醋酸銨溶液(30∶70);流速:0.3 mL/min;檢測波長:484 nm。西紅花樣品、金橙Ⅱ的紫外色譜圖、TIC圖及MRM圖見圖1和圖2。標準品與樣品進樣量均為1μL。

2.1.2 質譜條件

離子源參數:離子化模式為ESI+;毛細管電壓為2.24 kV;樣品錐孔電壓為60 V;二孔錐孔電壓為3 V;六極桿透鏡電壓為0.3 V;離子源溫度為150℃;脫溶劑氣溫度為250℃;脫溶劑氣流量為600 L/HR;錐孔氣流量為50 L/HR。

質譜相關參數:一級質譜分辨率為15.0，離子能量為0.5 eV;二級質譜分辨率為15.0，離子能量為1.0 eV;光電倍增管電壓為650 V;碰撞能量為30 V;氬氣流速為0.16 mL/L。

子離子掃描參數:母離子質量數為328.9 m/z;子離子掃描范圍100.0～340.0 m/z;樣品錐孔電壓為60 V;碰撞能量為30 V;掃描時間為0.2 s;掃描時間間隔為0.1 s;通道之間掃描間隔(Interchannel delay)為0.02 s。二級離子監測掃描模式(MRM)參數見表1。

2.2 溶液制備

圖1 樣品的LC－MS/MS分析圖

圖2 金橙Ⅱ的LC－MS/MS分析

表1 MRM參數

精密稱取金橙Ⅱ適量，用甲醇定量至100 mL，得對照品貯備液，精密吸取該溶液適量，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密稱取西紅花樣品粉末(過40目篩)0.2 g，加70%乙醇20 mL后稱重，超聲提取20 min，放冷，用70%乙醇補足減失的質量，取70%乙醇液，過0.2μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

標準曲線繪制:精密稱取金橙Ⅱ10.87mg，用甲醇定容至100mL，得對照品貯備液，精密吸取此溶液 0.5，2.0，5.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇到刻度，搖勻，進樣1μL;精密稱取金橙Ⅱ14.90 mg，加甲醇定容至10 mL，得對照品貯備液，精密吸取此溶液1.0，5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇到刻度，搖勻，進樣1μL。以對照品質量濃度對峰面積平均值作圖，線性回歸方程為 A=306.511 2+112.364 5 C，r=0.999 0。結果表明，金橙Ⅱ的進樣量線性范圍為5.435 ～ 745.0 ng。

精密度試驗:取同一質量濃度的對照品溶液，連續5次進樣。結果峰面積的 RSD為0.58%(n=5)。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，于10 h內每隔2 h進樣1次。結果金橙Ⅱ含量的 RSD為1.23%(n=5)，表明供試品溶液在10 h內保持穩定。

重復性試驗:取同一樣品各5份，依法制備供試品溶液并測定含量。結果金橙Ⅱ含量的 RSD為1.49%(n=5)。

回收率試驗:精密稱取已知不含金橙Ⅱ的西紅花粉末5份，分別加入金橙Ⅱ溶液適量(精密稱取金橙Ⅱ14.90 mg，用甲醇定容至10 mL，得對照品貯備液;精密吸取此溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，精密移取0.3 mL)，依法測定。結果見表2。

表2 樣品中金橙Ⅱ回收率試驗(n=5)

檢測限確定:通過逐級降低對照品溶液質量濃度，進樣測定，確定金橙Ⅱ的最小檢出限(S/N=3)為6μg/L。

2.4 樣品檢測

取4批樣品，依法測定含量，結果樣品Ⅰ中金橙Ⅱ含量為2.624 mg/g，樣品Ⅱ～Ⅳ中未檢出金橙Ⅱ。取樣品，經液相色譜柱分離后進入質譜儀，產生了[M+H－Na]+峰328.9(金橙Ⅱ的分子式為C16H11N2NaO4S，相對分子質量為350.3)，二級質譜的特征碎片離子(107.8，127.8，155.9，172.7)明顯。樣品及對照品的質譜圖見圖1和圖2。

3 討論

金橙Ⅱ易溶于70%乙醇，選擇超聲前處理法可快速完全地將金橙Ⅱ從樣品中提取出來。超聲處理時間(5，10，20，30 min)考察結果表明，20 min樣品已提取完全。

金橙Ⅱ的檢測方法有高效液相色譜法[1]。由于超高效液相色譜與傳統的高效液相色譜技術相比效率更高，因而具有更強的分離能力。超高效液相色譜提供了超高速度、高靈敏度，金橙Ⅱ出峰時間在1.7 min，全部分析在3 min內即可完成。本檢測方法簡單、快速、準確，為快速檢定西紅花中摻加的金橙Ⅱ提供了可靠依據。

[1]顧萬江，肖義夫.食品中金橙Ⅱ反相高效液相色譜法測定[J].預防醫學情報雜志，2006，22(6):753－755.