減肥類保健食品中非法添加鹽酸西布曲明和酚酞的定性定量檢測

薛磊冰，歐貝麗，沈春燕，朱山寅，章展煌

目前市場上的減肥保健食品魚龍混雜，一些不法商家為了追求功效，在保健食品中非法添加化學(xué)藥物，最常見的添加藥物是鹽酸西布曲明和酚酞。目前檢測這類藥物的方法多為液質(zhì)聯(lián)用法[1－2]和高效液相色譜法[3]。筆者建立了檢測鹽酸西布曲明和酚酞的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC－MS/MS)法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Acquity UPLC型超高效液相色譜儀(美國Waters公司);Quattro Premiere XE型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;10～100μL和100～1000μL單道可調(diào)移液器(德國Eppendorf公司)。鹽酸西布曲明對照品(批號為100624－200401)、酚酞對照品(批號為100102－199404)，均購自中國藥品生物制品檢定所;瘦身美體膠囊(批號為W200903271)，粒可瘦田田雪清減潤腸膠囊(批號為09030138)，天鳳降脂靈膠囊(批號為20090803)，纖婷櫻花精油減肥膠囊(批號為2009062301)，均為浙江省嘉興市各縣市、區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局提供的市場監(jiān)督抽檢品;甲醇(德國Merck公司)、甲酸(美國Tedia公司)均為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Acquity BEH －C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm);流動相:流動相A為0.1%甲酸甲醇溶液，流動相B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫(表 1);柱溫:40 ℃ ;流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子化方式:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子采集模式;毛細(xì)管電壓:2.5 kV;二級錐孔電壓(extractor):3 V;六級桿透鏡電壓 (RFLen):0 V;離子源溫度:110℃;脫溶劑氣溫度(desolvation temp):300℃;脫溶劑氣流量:700L/h;錐孔反吹氣流量:50 L/h。采用一級全掃描模式(MSScan)時，質(zhì)荷比范圍為 200～450(ESI+)，錐孔電壓范圍為 20～35 V;選擇離子二級全掃描模式(daughter scan)、二級離子監(jiān)測掃描模式(MRM)時，化合物的準(zhǔn)分子離子峰、主要子離子碎片峰及其采集參數(shù)見表2。

表1 流動相梯度洗脫表

表2 鹽酸西布曲明和酚酞的二級質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液制備

精密稱取鹽酸西布曲明對照品50.0 mg和酚酞對照品50.0 mg，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液;精密量取該溶液適量，用流動相逐步稀釋制成質(zhì)量濃度為200 ng/mL的混合對照品溶液。取樣品10粒，精密稱定，將內(nèi)容物置碾缽中研磨混勻，稱取1粒樣品的量，置100 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解15 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后過濾，取續(xù)濾液適量，用流動相逐步稀釋，作為供試品溶液。

2.3 定性鑒別

分別取混合對照品溶液和供試品溶液各5μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，在相同的色譜及質(zhì)譜條件下，對供試品溶液和對照品溶液進(jìn)行一級全掃描質(zhì)譜分析(MSScan)，均檢測到鹽酸西布曲明和酚酞的準(zhǔn)分子離子峰 m/z 280和 m/z 319(圖1);分別對 m/z 280和m/z319進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜分析，均產(chǎn)生完全一致的碎片離子(圖2);選擇豐度較強(qiáng)、性質(zhì)較穩(wěn)定的兩個子離子作為提取離子進(jìn)行MRM分析，獲得相應(yīng)的MRM色譜圖，供試品與對照品溶液的MRM色譜峰保留時間一致(圖3)。結(jié)合一級全掃描質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子、二級質(zhì)譜裂解碎片、多反應(yīng)檢測模式色譜峰保留時間三方面的信息，可證實(shí)這4批減肥類保健食品中均添加了鹽酸西布曲明和酚酞。

圖1 一級全掃描離子流圖和質(zhì)譜圖

圖2 二級全掃描質(zhì)譜圖

圖3 MRM色譜圖

2.4 定量測定

2.4.1 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密量取2.2項(xiàng)下鹽酸西布曲明對照品貯備液500μL和酚酞對照品貯備液200μL，置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，制成鹽酸西布曲明和酚酞質(zhì)量濃度分別為2μg/mL和5μg/mL的混合對照品溶液。取該溶液，逐步用流動相稀釋至鹽酸西布曲明質(zhì)量濃度為 400，200，100，40，20 ng/mL，酚酞質(zhì)量濃度為 1 000，500，250，100，50 ng/mL 的混合對照品溶液，分別吸取5μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，選擇性質(zhì)穩(wěn)定的兩個子離子作為提取離子，表1中用“_”標(biāo)注的碎片離子作為定量離子，另一個作為輔助定性離子，測定鹽酸西布曲明和酚酞定量離子的峰面積(X)，計算得質(zhì)量濃度的回歸方程分別為 Y=0.003 463 X－94.10(r=0.999 0)和 Y=0.007 534 X －115.68(r=0.999 5)。結(jié)果表明，鹽酸西布曲明質(zhì)量濃度在20～2 000 ng/mL、酚酞質(zhì)量濃度在50～5 000 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品細(xì)粉，精密稱取0.5粒的量，置50 mL容量瓶中，精密加入鹽酸西布曲明對照品貯備液12，15，18 mL，酚酞對照品貯備液5，6，7 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，照2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

定量限試驗(yàn):取對照品溶液，稀釋成不同質(zhì)量濃度的溶液后，采用MRM方式進(jìn)行測定。結(jié)果鹽酸西布曲明和酚酞的最低定量限(S/N=10)分別為 0.05，0.4 ng/mL。

精密度試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液5μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，以280＞125通道的MRM色譜峰峰面積計算。結(jié)果峰面積的RSD為1.6%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，每隔一定時間分別測定其鹽酸西布曲明和酚酞的含量。結(jié)果的 RSD為1.2%(n=5)，表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2 樣品含量測定

取2.2項(xiàng)下供試品溶液5μL，分別注入液質(zhì)聯(lián)用儀，按2.1項(xiàng)下所述方法和參數(shù)進(jìn)行MRM分析，測定鹽酸西布曲明和酚酞定量離子的MRM色譜峰峰面積，代入回歸方程計算含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

鹽酸西布曲明是一種新型中樞性作用的肥胖癥治療藥，對控制體重有較好的療效，但長期服用可引起失眠、頭痛、頭暈等不良反應(yīng)[4]。酚酞則有促進(jìn)腸蠕動而起到緩瀉的作用，長期服用會誘發(fā)頑固性便秘、腸炎皮疹、大出血等。筆者曾對市場上的減肥類保健品進(jìn)行抽檢，發(fā)現(xiàn)多批樣品中均添加了鹽酸西布曲明和酚酞。因此，對此類化學(xué)藥物建立準(zhǔn)確、靈敏、可靠的檢測方法很有必要。

本研究采用Acquity BEH C18色譜柱進(jìn)行分析，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法比較，分析時間大大縮短，同時具有更高的靈敏度和更好的分離度;以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式采集定量離子，以其峰面積代入回歸方程，可以準(zhǔn)確計算出樣品中被添加的鹽酸西布曲明和酚酞的含量。MRM模式具有靈敏度高、干擾小等優(yōu)點(diǎn)，可使色譜行為相似的物質(zhì)，根據(jù)分子量和碎片質(zhì)量的不同而得到完全分離，并可顯著去除基質(zhì)干擾。

過高濃度的樣品不僅易對質(zhì)譜造成污染，同時也會產(chǎn)生離子抑制現(xiàn)象，從而影響樣品測定的準(zhǔn)確率，因此不宜選擇過寬的線性范圍。同樣，在測定實(shí)際樣品時，由于違法添加化學(xué)藥物的保健品不會標(biāo)示添加物的含量，因此樣品的配制應(yīng)盡量避免過高濃度。測定時，以濃度較低的供試品溶液初步探索樣品中添加物的含量，再根據(jù)需要測定濃度較高的樣品，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1]車寶泉.液質(zhì)聯(lián)用檢查中藥制劑及保健食品中減肥類藥物[J].藥物分析雜志，2009，29(4):633.

[2]曾祥林.HPLC－MS/MS檢測中藥制劑及保健食品中添加6種減肥藥物的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2009，44(17):1 339.

[3]胡 青，季 申.減肥類保健食品中非法添加酚酞定性定量檢測方法的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2007，42(8):624.

[4]曾 濤.常用減肥藥物的不良反應(yīng)[J].中國藥師，2007，10(6):599.