糖尿病和卵巢去勢對大鼠NO、TGF-β1及骨密度的影響及相互作用

高紅偉 劉中浩 邢德國 王 亮 宮明智

(山東大學第二醫院骨外一科，山東 濟南 250033)

糖尿病因其高發病率、高致殘率引起世人關注，而在糖尿病基礎上發生的骨質疏松使患者生活質量下降，且容易導致骨折，嚴重加重家庭及社會經濟負擔。絕經后骨質疏松是老年婦女常患的一種代謝性骨病。絕經后的老年糖尿病病人常是糖尿病性骨質疏松和絕經后骨質疏松并存，此類病人在臨床上較為常見，因此其防治引起了人們的關注。雌激素、一氧化氮(NO)、轉化生長因子 β1(TGF-β1)已被證實與骨代謝有關〔1～4〕。本實驗通過觀察糖尿病去勢大鼠模型中 NO、TGF-β1、雌激素、骨密度的變化，探討糖尿病與絕經導致骨質疏松的機制，以及糖尿病與絕經在骨質疏松發生上有無相互作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，NO試劑盒(南京建成生物研究所)，ELISA試劑盒(德國 DRGGmbH公司)，雙能X射線骨密度測定儀(美國NORLAND)，兔抗大鼠TGF-β1單克隆抗體，生物素化山羊抗兔 IgG，TGF-β1SABC試劑盒(武漢博士德公司)，Leica-Qwin計算機圖像分析系統(德國)。

1.2 實驗動物模型制備 健康清潔級3月齡雌性Wistar大鼠160只，體質量180～200 g，由山東大學動物實驗中心提供。將160只大鼠隨機分為四組:正常對照組(A組)，糖尿病模型組(B組)，單純去勢模型組(C組)，糖尿病并發去勢模型組(D組)。①糖尿病模型組(B組):隨機選取3月齡Wistar雌性大鼠80只，腹腔內注射鏈脲佐菌素60 mg/kg，定向破壞胰島細胞，3 d后測血糖高于16.8 mmol/L者為糖尿病大鼠模型制作成功。②單純去勢模型組(C組):隨機選取3月齡Wistar雌性大鼠40只，腹腔內注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg體重，麻醉成功后，將該種動物固定，下腹部剪毛，用碘酒、酒精常規消毒局部，于無菌條件下取下腹正中切口，長約1.5 cm，逐層鈍性分離進入腹腔，完整切除雙側卵巢，止血后逐層縫合、關腹。術后肌肉注射青霉素2萬U/kg共7 d，術后7 d拆線。③糖尿病并發去勢模型組(D組):隨機選取成模后1 w的糖尿病大鼠模型40只，在此基礎上進行去勢手術，方法同②。④正常對照組(A組):隨機選取3月齡Wistar雌性大鼠40只，腹腔內注射生理鹽水，1 w后行手術，手術方式同“去勢”手術，不切除卵巢，只切除大網膜脂肪。

1.3 血清雌激素、NO、TGF-β1檢測 分別于第4，8，12，16周自股靜脈取兩組大鼠血液，高速離心后取血清，放置于-20℃冰箱內。采用放免法測血清雌激素水平;硝酸還原酶法測血清NO水平;ELISA法檢測血清TGF-β1水平。

1.4 骨密度(BMD)檢測 分別于第4，8，12，16周麻醉狀態下于兩組中各取10只大鼠的右側股骨，制作病理切片，以雙能X射線骨密度測定儀檢測骨密度。

1.5 免疫組織化學染色檢測股骨TGF-β1的表達 采用SABC法進行免疫組織化學檢測，實驗步驟按說明書操作。TGF-β1一抗工作濃度為1∶50，棕黃色至深褐色染色為陽性染色。應用Leica-Qwin計算機圖像分析系統在相同灰度閾值設定條件下，自動測出視野內免疫熒光陽性染色灰度值。

1.6 統計學分析 數據均以x±s表示，采用SPSS16.0統計軟件進行方差分析，同時應用LSD及Dunnet-t檢驗，分析糖尿病及卵巢去勢兩因素間是否存在相互作用。

2 結果

2.1 大鼠血清雌激素水平 隨著實驗的進行，四組大鼠雌激素水平均逐漸降低。四組相比較，B組與A組差異、C組與D組差異無統計學意義，C、D組與A、B組差異有統計學意義。A、B兩組雌激素水平各時間點差異無顯著性意義，C、D兩組第4和8周、第8和16周差別有統計學意義(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t檢驗分析糖尿病與卵巢去勢對雌激素影響無相互作用。見表1。

2.2 大鼠血清NO水平 實驗結果顯示，四組大鼠血清NO水平均逐漸降低。四組相比較，B、C、D組與A組差異有統計學意義，C組與D組差異無統計學意義。而C與B、D與B相比，血清NO水平降低更為明顯，其差異均有統計學意義。A組血清NO水平各時間點差異無顯著性意義，B、C、D各組第4和8周、第8和16周差別有統計學意義(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t檢驗分析糖尿病與卵巢去勢對血清NO水平影響無相互作用。見表2。

表1 大鼠血清雌激素水平(x ±s，n=10，nmol/L)

2.3 大鼠血清TGF-β1水平 實驗結果顯示，A、D大鼠血清TGF-β1水平變化不明顯，各時間點無統計學差異，且兩組相比亦無統計學差異。B組血清TGF-β1水平逐漸升高，各時間點有統計學差異。C組血清TGF-β1水平逐漸降低，各時間點亦有統計學差異。B、C與A組相比，差異明顯(P＜0.05)。同樣LSD及Dunnet-t檢驗分析糖尿病與卵巢去勢對血清TGF-β1水平影響無相互作用。見表3。

表2 大鼠血清NO水平(x ±s，n=10，μmol/L)

表3 大鼠血清TGF-β1水平(x ±s，n=10，mg/L)

2.4 大鼠股骨BMD水平 實驗結果顯示，四組大鼠股骨BMD均逐漸降低。四組相比較，B、C、D組與A組差異有統計學意義。C與D、C與B差異無統計學意義，而D與B相比，差異明顯(P＜0.05)。A組股骨BMD各時間點差異無顯著性意義，B組第4和8周、第8和16周差別有統計學意義(P＜0.05)，C、D組第8和12周、第12和16周差別有統計學意義(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t檢驗分析糖尿病與卵巢去勢對股骨骨密度影響無相互作用。見表4。

2.5 大鼠骨組織中 TGF-β1的表達 A組大鼠骨組織中TGF-β1染色呈陽性，主要分布在成骨細胞胞質，部分骨基質中也有陽性表達，其陽性細胞染色數目逐漸下降，但各時間點差異無顯著性意義(P＞0.05)。而B、C、D三組骨組織中TGF-β1的表達范圍未變，但各時間點陽性細胞染色數目下降明顯，甚至不表達，與A組對應時間點比較，表達明顯降低(P＜0.01)。C與D、C與B相比差異無統計學意義，而D與B相比，差異明顯(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t檢驗分析糖尿病與卵巢去勢對局部骨組織中TGF-β1的表達無相互作用。見表5、表6。

表4 大鼠股骨BMD水平(x ±s，n=10，g/cm2)

表5 大鼠骨組織中TGF-β1陽性細胞數水平(x ± s，n=10)

表6 大鼠骨組織TGF-β1灰度值水平(x ± s，n=10)

3 討論

骨質疏松是一種系統性骨骼疾病，是導致骨折的重要原因。糖尿病可導致多個系統的病變，能影響骨代謝引起骨質疏松，雌激素缺乏也被認為是老年婦女出現骨質疏松的主要原因。而臨床上常見到絕經后糖尿病病人，他們常同時存在糖尿病性骨質疏松和絕經后骨質疏松。有研究認為某些細胞因子會影響骨代謝，導致骨質疏松的發生〔5，6〕。

雌激素通過作用于成骨細胞上的雌激素受體，改善骨的代謝，減少骨的吸收，它還可抑制甲狀旁腺介導的骨吸收并增加腸道和腎臟對鈣的重吸收，升高血鈣水平，促進骨的形成〔1〕。本實驗說明去勢仍是雌激素降低的主要因素，糖尿病對雌激素影響較小，當兩因素同時存在時，統計學顯示兩者無相互作用。

NO廣泛存在于機體的各種組織中，能誘導破骨細胞的凋亡，抑制成熟破骨細胞的活性，減少骨吸收〔2〕。本實驗說明糖尿病、卵巢去勢均可影響血清NO水平，使其降低。有研究顯示NO與BMD有關〔3〕，并通過降低對破骨細胞活性的抑制作用，增強骨吸收，導致BMD降低，本實驗結果與其相符。研究提示在去卵巢大鼠中，雌激素水平降低，可導致NO水平下降，減輕對破骨細胞活性的抑制，增加骨吸收〔4〕，導致BMD減低，本實驗中卵巢去勢組及糖尿病并發去勢組的結果與其相符。但本實驗提示糖尿病骨質疏松中可能存在其他機制導致NO降低。本實驗推測糖尿病、卵巢去勢兩因素對血清NO水平具有疊加作用，也從另一角度支持了Undurti的研究。

TGF-β1在機體中廣泛存在，尤其在骨組織中含量最為豐富。TGF是一類對靶細胞具有多種特殊作用的細胞生長和分化調節蛋白。TGF-β1在不同條件下，既可促進成骨細胞分化，又可降低其分化;而且還可支持破骨細胞形成，刺激骨的吸收;它是骨形成和骨吸收之間重要的偶聯調節因子〔7〕。TGF-β1可以促進雌激素受體表達，增強雌激素抑制骨丟失的功能〔8〕;雌激素減少亦可通過直接作用于骨細胞引起TGF-β1分泌減少。本實驗發現糖尿病大鼠血清TGF-β1逐漸升高，與正常組差別有統計學意義，這與Mather等〔9〕實驗結果一致，他認為血清TGF-β1升高可能和高血糖、腎臟代謝以及RAS系統有關;單純卵巢去勢組血清TGF-β1降低，與正常組差別有統計學意義，這和既往研究相符〔10〕。另外，TGF-β1在對照組骨組織中呈陽性染色，主要分布在成骨細胞胞質，部分骨基質中也有表達，說明TGF-β1在正常情況下參與了骨代謝平衡的維持。而TGF-β1在糖尿病、卵巢去勢組大鼠骨組織中表達較弱，說明糖尿病、卵巢去勢均影響骨組織中TGF-β1的表達，導致骨代謝失衡。對實驗中血清TGF-β1水平、陽性細胞數及灰度值的數據進行統計分析，未發現糖尿病與卵巢去勢有相互作用，但根據各指標結果，我們仍推測糖尿病及卵巢去勢間存在疊加作用，并推測糖尿病及卵巢去勢不存在影響TGF-β1的共同徑路，可能是通過不同途徑影響骨組織中TGF-β1的結果。

本實驗中，糖尿病組、單純去勢組及糖尿病并發去勢組大鼠股骨BMD均降低，與正常組差別有統計學意義，并且糖尿病與卵巢去勢對股骨骨密度的影響沒有協同或拮抗作用，但兩因素同時存在時骨密度降低較大，推測糖尿病與卵巢去勢對骨密度的影響存在疊加作用。TGF-β1被證實與骨代謝有關，TGF-β1基因缺失可導致骨密度降低，同樣NO也被證實可促進骨形成，抑制骨吸收，增加eNOS基因的表達或提供外源性NO均可導致骨密度升高〔11，12〕，這和本實驗結果均相符。但是 NO，TGF-β1在骨質疏松的發生機制中是否有相互作用，在糖尿病及卵巢去勢的干預下導致骨密度降低的原理仍需進一步的實驗研究。

綜上所述，糖尿病、卵巢去勢以及兩者同時存在時均能夠引起大鼠骨密度降低，導致骨質疏松。糖尿病及卵巢去勢對血清NO、血清TGF-β1、骨組織TGF-β1及骨密度的影響無明顯的相互作用，但根據結果數據，我們推測兩者對上述指標的影響存在疊加作用。即糖尿病與卵巢去勢同時存在時，骨密度降低幅度更大，可出現更嚴重的骨質疏松。

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