80歲以上老年惡性腫瘤患者外周血調節性T細胞檢測及其臨床意義

尹震宇 郭美姿 黃明敏 陳曉琳 陳軍浩 吳虹

我國腫瘤發病率和死亡率均在55～60歲段開始呈大跨度上升，65歲年齡組比55歲年齡組翻1倍，70歲年齡組比55歲年齡組翻2倍，80歲年齡組是55歲年齡組的3倍［1］。這說明，惡性腫瘤已成為老年人的常見病，也是老年人主要的死亡原因。隨著內環境的變化，老年人逐漸出現實質臟器的萎縮并伴有功能降低，包括免疫衰退，表現為T細胞活化受損，細胞免疫功能缺陷。因此對外源性抗原的免疫應答降低，而對自身成分產生抗體陽性率增加。CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)是一組具有免疫抑制功能的T細胞亞群，具有免疫負調節作用，近年來在惡性腫瘤的發生、發展及預后中的作用更是備受關注，成為免疫學和腫瘤學領域研究的熱點［2］。本研究旨在探討Treg在≥80歲老年惡性腫瘤患者中的作用。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 ≥80歲老年惡性腫瘤組(腫瘤組)患者均為我院老年科2010年6月至2011年3月住院患者，均經病理證實。共70例，男65例，女5例，年齡80～91歲，平均(84.0±3.59)歲。其中肺癌17例，腸癌14例，胃癌12例，前列腺癌9例，肝癌7例，食管癌2例，胰腺癌2例，膽管癌2例，膀胱癌2例，腎癌2例，乳腺癌1例。根據國際抗癌協會標準進行臨床分期，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期9例，Ⅲ期14例，Ⅳ期36例。根據Karnofsky法評定患者功能狀態，其中0分1例，10分2例，20分6例，30分4例，40分11例，50分12例，60分4例，70分4例，80分5例，90分17例，100分4例。老年健康對照組(對照組)均為健康體檢者，30例，男27例，女3例，年齡80～98歲，平均(83.7±4.63)歲，符合中華醫學會老年醫學分會提出的健康老年人標準。2組的年齡及性別比差異無統計學意義。

1.2 方法 惡性腫瘤患者于入院次日晨6:00自肘正中靜脈取血2 ml，EDTA抗凝。應用熒光直接標記法及流式細胞儀檢測外周血CD4+CD25+Treg細胞水平。取不同熒光標記的單克隆抗體(PE標記的CD4抗體，FITC標記的CD25抗體，Cychrome標記的CD69和 CD45 RA 抗體)各20 μl，分別加入100 μl肝素抗凝的外周血，室溫下孵育15 min，加紅細胞裂解液，PBS洗滌2次，用流式細胞儀檢測，Cellquest軟件分析數據，記錄陽性細胞百分率，減去非特異對照值。另取2 ml采用日立7600全自動生化儀用免疫比濁法檢測血清C－反應蛋白(CRP)。

1.3 統計學方法 應用SPSS 15.0統計軟件進行分析。所有計量資料用均數±標準差表示，2組間比較采用t檢驗。2組間計數資料比較采用卡方檢驗。2個變量間的關系采用Pearson或Spearman直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組和對照組血漿Treg水平及血清CRP水平比較 腫瘤組血漿Treg、血清CRP水平與對照組比較明顯升高，差異具有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 腫瘤組和對照組血漿Treg、血清CRP水平比較(±s)

表1 腫瘤組和對照組血漿Treg、血清CRP水平比較(±s)

注:與對照組比較，＊＊P＜0.01

組別 Treg(%) CRP(mg/L)腫瘤組(n＝70) 9.08±4.12＊＊ 18.92±29.02＊＊對照組(n＝30)6.09±1.41 0.87±0.65

2.2 直線相關分析 腫瘤組血漿Treg水平與血清CRP水平及腫瘤 TNM分期呈正相關(r＝0.416、0.248，P均 ＜0.01)，與 KPS評分呈負相關(r＝－0.438，P ＜0.01)。

3 討論

當機體發生腫瘤時，腫瘤細胞可以憑借多種方式逃避免疫系統的監控而分裂生長。Treg是一組具有免疫抑制功能的T細胞亞群，于1995年由Sakaguchi等在對小鼠自身免疫性疾病的研究中首次發現。Treg來源于CD4+的T細胞，為胸腺發育過程中經歷陰性和陽性選擇時部分自身反應性T細胞逃避選擇的結果。它占正常人外周血CD4+T細胞的5%～10%，具有免疫負調節作用，在維持自身免疫耐受等病理生理過程中有著不可替代的作用，近年來在惡性腫瘤的發生、發展及預后中的作用更是備受關注，成為免疫學和腫瘤學領域研究的熱點［3］。無論在腫瘤環境下還是在疫苗誘導下的抗腫瘤免疫中，Treg都扮演了負面角色。許多腫瘤抗原為自身抗原，Treg能抑制T細胞對外來和自體抗原的免疫應答，因而在維持對自身成分耐受的同時也會阻止機體對腫瘤細胞的免疫應答，從而導致了腫瘤的免疫逃逸［4］。Salama等［5］通過免疫組化方法觀察967例臨床分期為Ⅱ期、Ⅲ期的結直腸癌患者組織中Treg的分布情況，結果顯示Treg在腫瘤組織的比率遠高于正常腸黏膜，而且Treg與臨床分期、生存率明顯相關，進一步行多元回歸分析提示Treg是結直腸癌預后的獨立危險因子，Treg越高，預后越差。Tzankov等［6］應用ROC工作曲線，分析了Treg在1019例不同類型的淋巴瘤中的診斷價值。結果表明，腫瘤組織中Treg的數目與經典霍奇金淋巴瘤腫瘤的總生存率、無病生存率明顯相關，與惰性淋巴瘤的無病生存率、疾病生存率相關，與彌漫大B細胞淋巴瘤的疾病生存率相關。通過對腫瘤患者外周血及腫瘤微環境中Treg的研究發現，頭頸部鱗癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者體內的Treg的數目亦明顯上升，其數量與病人的生存率明顯相關［7－13］。環境中Treg比率增加，抑制了體內效應性 T細胞的抗腫瘤免疫反應，導致腫瘤免疫失調，從而促進了腫瘤的快速生長及侵襲和轉移。

目前，Treg數目是否隨著年齡的增加而增多仍存在爭議［2，14－15］，Treg 在≥80 歲老年人惡性腫瘤中的作用如何?國內外鮮見報道。為剔除年齡因素的影響，本研究比較了≥80歲的老年人惡性腫瘤患者及≥80歲健康老年人外周血中Treg的比率。結果顯示，≥80歲老年惡性腫瘤患者外周血Treg比率明顯高于同齡健康老年人(P＜0.01)。提示惡性腫瘤患者Treg數目增加是腫瘤免疫抑制的機制之一，亦可能是導致機體免疫力下降的原因之一。因此，在≥80歲老年惡性腫瘤患者中檢測外周血Treg比率具有一定的臨床意義。CRP為急性時相蛋白，在正常人血清中含量很低。在惡性腫瘤時，機體釋放多種細胞因子，這些細胞因子一方面促進腫瘤轉移，另一方面可調節誘導肝細胞合成大量的CRP，因此血清中CRP的變化對了解惡性腫瘤患者的狀態有著重要意義。一般來說，高水平的CRP濃度或進行性升高均提示預后不良，往往預示腫瘤的轉移擴散，當病情得到緩解時又迅速恢復正常，因此認為CRP可以作為判斷惡性腫瘤預后的參考指標。我們的研究顯示，≥80歲老年惡性腫瘤患者血清CRP濃度明顯高于同齡健康老年人，差異有統計學意義(P＜0.01)。通過直線相關分析，結果顯示，在≥80歲老年惡性腫瘤患者中，外周血Treg比率與CRP濃度呈正相關(r＝0.416，P＜0.01)，提示Treg可能亦可作為判斷惡性腫瘤預后的參考指標。目前，腫瘤的臨床分期及患者的行為狀態成為腫瘤明確的預后因素。為此，我們通過直線相關分析，進一步分析了外周血Treg比率與腫瘤臨床分期及KPS評分之間的相關關系。結果表明，在≥80歲老年惡性腫瘤患者中，外周血Treg與腫瘤的臨床分期呈正相關，與KPS評分呈負相關關系，進一步支持檢測≥80歲老年惡性腫瘤患者外周血Treg比率，可評估腫瘤患者的預后。

由于本研究樣本量較小，且腫瘤病種較多，無法進一步行ROC曲線分析Treg在診斷惡性腫瘤的敏感性、特異性。在我們的研究中，Treg比率與臨床分期、CRP濃度、KPS評分的相關系數數值偏小，可能與各種腫瘤細胞的代謝及浸潤程度有關。故今后還需進一步的研究證實檢測Treg在≥80歲老年惡性腫瘤患者中的臨床意義。

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