不同產地金櫻子根、陽枝總鞣質的含量測定

單于超 郭巧玲 莊銀鳳 田素英

1．廣東省肇慶星湖制藥有限公司，廣東 肇慶 526000;2．廣東省新興中藥學校，廣東 新興 527400;3．廣東藥學院中山校區，廣東 中山 528458

金櫻根為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx的干燥根［1］，為民間常用藥物，具有固精澀腸功效，主要用于治療滑精、遺尿、痢疾泄瀉、崩漏帶下、子宮脫垂、痔疾、燙傷等癥。近年來金櫻根受到較廣泛的應用，如婦科千金片、金雞膠囊、廣東涼茶、三金片、三金顆粒等［2］。目前金櫻根用藥部位較混亂，有根、地上莖、地下莖 (陽枝)總鞣質含量有所差異，各地所產良莠不一，以致于使金櫻根質量不穩定。本實驗對采自湖南、江西、廣西、廣東南雄、潮州、新興和中山七個不同地域的金櫻根、地上莖、陽枝 (產地稱與金櫻根藥材顏色相近地上老莖為陽枝，以下同)的總鞣質含量進行測定，以便制定金櫻根質量標準，也可更充分地開發利用金櫻子這一藥用植物。

1 主要材料與儀器

金櫻根、莖藥材 (購于廣東省中山市同心藥業有限公司，批號:20101013，經廣東藥學院中山校區田素英副教授鑒定為金櫻子 (Rosa laevigata Michx.)的干燥根、莖);沒食子酸標準品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110831－200302);干酪素 (上海潤捷化學試劑有限公司，批號:20081013);鎢酸鈉 (天津市百世化工有限公司，20090818);鉬酸鈉 (天津市化學試劑四廠，20041015);硫酸鋰 (天津市瑞金特化學品有限公司);丙酮 (天津市富宇精細化工有限公司);無水碳酸鈉 (江蘇強盛化工有限公司，20081227);鹽酸 (廣州化學試劑廠);磷酸 (江蘇強盛化工有限公司)等。所用試劑均為分析純。KQ－500型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);UV－1102型紫外－可見分光光度計 (上海天美科學儀器有限公司);HWS26電熱恒溫水浴鍋 (上海一恒科技儀器有限公司)等。

2 試驗方法與結果

2.1 制備所用溶液

2.1.1 磷鉬鎢酸試劑的制備 取鎢酸鈉100g，鉬酸鈉25g置圓底燒瓶中，加水700mL使溶解，加鹽酸100mL，磷酸50mL，加熱回流 l0h，放冷，再加硫酸鋰 150g，蒸餾水50mL和溴0.2mL，煮沸除去殘留的溴 (約15min，溶液由棕色漸變為黃色)，冷卻，加水稀釋至1000mL，濾過，即得，密封保存待用。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸標準品0．0260g，置于50mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，精密量取5.0mL置于100mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液 (每1mL溶液中含沒食子酸0．0260mg)。

2.1.3 待測樣品溶液的制備 稱取7個不同產地金櫻根、地上莖、陽枝粉末各10g，分別置于已貼有對應標簽的300mL具塞錐形瓶中，加30倍50%的丙酮于超聲波清洗器超聲提取30min后，濾過，用移液管分別吸取2mL濾液置已貼有對應標簽的100mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 最佳測定波長的選擇

分別取沒食子酸對照品、金櫻根、地上莖、陽枝總酚、不被干酪素吸附的多酚各2mL，分別置于20mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1mL，再分別加蒸餾水10mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。搖勻，放置30min。以相應的試劑為空白，在400～900nm范圍內進行掃描。結果顯示，沒食子酸對照品在768nm處有最大吸收，其它比色液均在約768nm具有最大吸收表明沒食子酸、金櫻根鞣質顯色后的產物有相同的吸收峰，故以768nm作為測定波長。

2.3 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL分別置于已貼有相應標簽的20mL棕色容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試劑 (顯色劑)1mL，然后分別加入蒸餾水 11.5mL、11mL、10mL、9mL、8mL、7mL、6mL。用29%碳酸鈉溶液稀釋 (緩沖劑，堿化溶液)至刻度，搖勻，靜置30min，以相應試劑為空白，在768nm的波長處測定吸光度，以吸光度 (A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，繪制沒食子酸吸光度－濃度標準曲線，得線性回歸方程為 Y=0.1332X+0.1088，相關系數 r=0.9991，表明沒食子酸在0.00065～0.0078mg·mL－1線性關系良好。

2.4 樣品鞣質含量測定［3］

總酚含量測定:精密量取金櫻根、地上莖、陽枝各供試品溶液1.0mL，置相對應的20mL棕色容量瓶中，按“2.3”測定各供試溶液總酚吸光度。通過標準曲線方程求出濃度，再根據稀釋倍數換算即可求得金櫻根總酚的含量。

不被干酪素吸附多酚含量測定:精密量取金櫻根、地上莖、陽枝各供試品溶液25mL加至已經盛有干酪素0.6g的100mL具塞的錐形瓶中，塞密，至30℃水浴中恒溫1h，時時振搖，取出、放冷、搖勻、過濾。精密量取濾液3.0mL置相對應的20mL棕色容量瓶中，按“2.3”測定吸光度，通過標準曲線方程求出濃度，再根據稀釋倍數換算即可求得個各個產地金櫻根、陽枝不被干酪素吸附多酚的含量 (結果見表1)。以下式計算鞣質含量:

鞣質含量=總酚含量－不被吸收的多酚含量

表1 不同產地金櫻根、地上莖、陽枝鞣質含量的測定

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度實驗

精密吸取同一沒食子酸對照品溶液2mL置20mL棕色容量瓶中，按“2.3”連續測定其吸光度A，重復5次，結果RSD為0.24%，表明該測定方法精密度良好。

2.5.2 穩定性實驗

精密吸取同一沒食子酸對照品溶液10mL置100mL棕色容量瓶中，按“2.3”在1h內每隔10min測定其吸光度A，結果RSD為0.36%。實驗表明，標準品在1h內是穩定的，同時發現其后30min比前30min更加穩定，因此有必要進行30min的顯色反應，保證結果更加準確。

2.5.3 重復性試驗

分別稱取同一產地 (新興)金櫻根樣品5份，每份10g，按“2.1.3”法制備供試品溶液，按“2.3”吸光度測定。結果總酚RSD0.79%，不被吸附多酚2.45%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的金櫻根 (新興)粉末10g(6份)，按“2.1.3”法制備供試品溶液。精密稱取0.0066g沒食子酸標準品，置100mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，得標準品溶液。分別移取以上樣品溶液及標準品溶液各0.5mL置相對應的20mL棕色容量瓶中 (6份)，按“2.3”測定吸光度，計算回收率，結果如表2所示。

表2 回收率試驗考查結果 (n=6)

3 討論

溫度過高鞣質不穩定，本次水浴溫度控制在30℃。根據前期的正交實驗，確定金櫻根鞣質最佳提取工藝為50%的丙酮溶液，30倍溶劑用量，超聲波法提取金櫻根粉末(過三號篩)30min，所以本次實驗采用此提取條件。

鞣質含量測定的方法主要有皮粉法、比色法、高錳酸鉀法、絡合滴定法、干酪素法、分光光度法等。磷鉬鎢酸－干酪素比色法與原來的皮粉法比較具有樣品取量少、靈敏、快速、操作簡便、成本低廉、方便實用、精密度高、對總鞣質專屬性強等特點。但本方法中，鞣質含有的多酚羥基與磷鉬鎢酸試液反應生成的藍色產物遇光不穩定，因此顯色反應應該避光操作，使用棕色容器。其中，鞣質的含量與顏色的深度成正比，所含鞣質越高，顏色越深，因此，應調整好樣品溶液的加入量，使最終測量時吸光度盡量落在0.2～0.7之間，保證較高的靈敏度，使結果更為準確、可靠。

當前市場有金櫻根、莖混用現象。鐘小清等在《金櫻根藥材的名實考證》中指出產地將金櫻根陽枝 (產地稱與金櫻根藥材顏色相近老莖為陽枝)作為一個副產品加以開發利用。由此看來，金櫻陽枝與根應該有相近的功效，所謂的金櫻莖代替金櫻根混入市場也源于此。本實驗選用七個不同產地的金櫻根、地上莖、陽枝進行鞣質含量測定，結果發現，若以鞣質作為主要成分的臨床用藥，金櫻子陽枝與根的鞣質含量平均相近，陽枝可替代金櫻根應用于臨床，而金櫻子莖鞣質含量明顯低于金櫻根，不應混入金櫻根中入藥。

從測量結果還可以發現，由于地域不同，同一用藥部位鞣質含量也有較大的差異，在該次實驗中，各個產地金櫻根鞣質含量從大到小排列為廣西＞中山＞新興＞湖南＞潮州＞江西＞南雄，且最大相差幅度為6.69%，平均含量為7.47%，考慮實驗因素，金櫻根鞣質最低含量不應低于8%。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典 (一部)［S］．北京:化學工業出版社，2010:附錄23．

［2］劉佩沂，田素英，梅全喜．金櫻根研究進展［J］．海峽藥學，2010，22(1):98－100．

［3］王克英，左宏笛，楊理明．紫外分光光度法測定石榴皮中總鞣質含量［J］．貴陽中醫學院學報，2007，29(6):66－67．

［4］鐘小清，呂高榮，鄒節明．金櫻根藥材的名實考證［J］．中草藥，2009，40(7):1140－1143．