高產β-葡聚糖酶菌株初步篩選與鑒定

邵金華，朱智勇，劉 歡，鄧 佳，歐陽青，李軍艷

（湖南科技學院，湖南 永州 425100）

β-葡聚糖酶是一類能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶類的總稱，包括1，3-1，4-β-葡聚糖酶、1，3-β-葡聚糖酶、1，2-1，4-β-葡聚糖酶、1，4-β-葡聚糖酶和1，3-1，6-β-葡聚糖酶，均屬于半纖維素酶類[1]。β-葡聚糖酶能降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷鏈，使之降解為小分子的還原糖和寡糖，失去親水性和粘性。隨著人們對β-葡聚糖酶的深入研究，β-葡聚糖酶在食品、釀造、飼料和日化等工業方面應用價值正逐漸地顯現出來[2]。β-葡聚糖酶作為一種新型添加劑，具有廣泛而顯著的經濟效益和社會效益，開發前景十分廣闊[3]。筆者對β-葡聚糖酶進行了深入的生物學研究，旨在篩選出能產生適應不同應用目標的β-葡聚糖酶的野生菌株，為今后生產出活力高、穩定性好的β-葡聚糖酶提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣 采自湖南省永州市陽明山、菜地、路邊、西山等地，取其3～10 cm深層土壤。

1.1.2 試 劑 標準大麥β-葡聚糖購自Sigma公司；β-葡聚糖，天津市光復精細化工研究所，純度99.9%；其他試劑均為AR級或BR級商品試劑。

1.1.3 培養基 （1）基本培養基（g/l00 mL）：蛋白胨 1.0，牛肉膏0.4，瓊脂 1.8，NaCl 0.4，pH值7.2,121℃滅菌25 min。（2）分離培養基（g/l00 mL）：大麥β-葡聚糖 0.2，剛果紅 0.004，瓊脂 1.8，KNO30.1，NaH2PO40.12，MgSO40.03，CaCO30.01，pH 值 7.2，121℃滅菌25 min。（3）發酵培養基（g/l00 mL）：大麥粉 4.0，玉米粉 3.0，豆餅粉 3.0，KH2PO40.002，Mg－SO40.02，CaCO30.05，pH 值 7.1，121℃滅菌 25 min。（4）PDA 培養基（g/l00 mL）：馬鈴薯（去皮）20.0，蔗糖（或葡萄糖）2.0，瓊脂2，水100 mL，pH值自然，121℃滅菌 25 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種初步篩選 （1）樣品的采集與處理：在永州市陽明山、菜地、路邊、西山等不同地點共采集了46個土樣，經去雜、風干裝入已滅菌的牛皮紙袋內，封好袋口，備用。（2）富集培養：稱取處理過的土樣l g，加入裝有50 mL已滅菌的富集培養基中的三角瓶中，30℃恒溫培養48 h，每4 h搖勻1次，每個土樣做3個平行。富集培養48 h后進行平板分離。（3）菌種分離：將富集培養物用無菌生理鹽水稀釋成 10-2～10-7六個梯度，選擇 10-4，10-5，10-6三個梯度試管菌種，用滅菌的移液管取0.5 mL，涂布接種到以β-葡聚糖為唯一碳源的分離培養基平板上，30℃培養2～3 d，每個梯度重復3次。從中挑取生長良好的菌落接種于斜面培養基保存。（4）菌種初篩：將分離出的菌種點接在初篩培養基平板上，置于30℃培養2～3 d，凡在菌落周圍能使剛果紅褪色形成透明圈的菌株，即為產酶菌株。將篩選出的菌株連續重復3次點接在初篩培養基上，挑選透明圈與菌落直徑之比大的菌株，接種斜面保存并編號。（5）菌種純化：將初篩出來的菌種點接在PDA培養上，連續培養5代，至每個菌種的每個菌株的菌落形態、顏色等相同，并在顯微鏡下觀察菌絲體、孢子的形態，直至純化為止。（6）菌種復篩：取斜面保藏的菌種，接種于新鮮的斜面培養基上進行活化，接種到液體產酶培養基中（250 mL三角瓶，內裝50 mL已滅菌的液體產酶培養基），于30℃，150 r/min搖床恒溫培養3 d。培養過程結束后，取發酵液進行β-葡聚糖酶活力的測定。（7）酶活力的測定：采用DNS比色法[4-5]。取4 mL搖瓶發酵液經8 000 r/min離心10 min。取上清液用0.2 mol/L、pH值5.0的乙酸緩沖液稀釋適當倍數，取經40℃預熱的此稀釋液1.0 mL，加入經40℃預熱的1.0% β-葡聚糖溶液1.0 mL，混勻，加入蒸餾水混勻，40℃下恒溫反應10 min，然后加入2.0 mL DNS停止反應，搖勻，100℃水浴5 min，冷卻至室溫后用去離子水定容至5.0 mL，測定OD520值。取稀釋酶液1.0 mL，先加入2.0 mLDNS，再加入1.0%β-葡聚糖溶液1.0 mL為空白溶液。酶活定義：在本試驗條件下，每分鐘分解β-葡聚糖產生相當于l μmol葡萄糖所需的酶蛋白的量定義為一個酶活單位。

1.2.2 菌種初步鑒定[6-7]（1）菌落形態特征觀察：將保藏的菌種接種于新鮮的斜面培養基上，進行菌種活化，活化后輕輕點接于PDA平板中央，30℃下恒溫培養2～3 d，3次重復，培養期間觀察菌落形態特征，并進行記錄、拍照。（2）顯微鏡下觀察（插片法）：取融化并冷卻至大約50℃的PDA培養基約20 mL倒平板，待培養基凝固后，將菌種劃線在培養基上，以無菌操作用鑷子將無菌的蓋玻片以大約45°角插入培養基內，其中蓋玻片與插入的面與劃的線平行，每個平板插3個，將平板倒置，30℃下恒溫培養，3次重復。待菌絲在蓋玻片上的長度大約0.5 cm后，用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面培養物，然后將有菌的一面朝上放在載玻片上，在顯微鏡下鏡檢。

2 結果與分析

2.1 菌種初篩結果

將分離后的菌株接種于初篩培養基平板上，30℃恒溫培養，能夠產生透明圈的菌株共有48株，如表1所示，透明圈直徑與菌落直徑之比>1.4的菌株有9株。

表1 平板初篩結果

2.2 菌種復篩結果

將初篩得到的9株菌株進行純化，純化后的菌株接種于產酶培養基中進行搖瓶培養，分析各菌株的產酶活力情況，結果如圖1所示，透明圈直徑與菌落直徑之比最大以及酶活最高的菌株為ZJ2132，因此，確定該菌株為后續研究的出發菌株。圖2為ZJ2132純化后30℃培養48 h后產生的形態。

圖1 初篩菌株產β-葡聚糖酶活力比較

圖2 ZJ2132在初篩培養基上的菌落形態

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌落形態特征 將活化后的ZJ2132菌種劃線接種于PDA培養基上，30℃恒溫培養3 d后，菌落平板如圖3所示：培養1 d時，菌落呈圓形、白色、致密，菌落直徑1 cm，菌絲呈白色，纖細；培養2 d時，菌落棉絮狀，產孢從束區排列成同心圓輪紋，中央產生綠色孢子，中央變成綠色，大部分菌絲為基內菌絲，匍匐生長，氣生菌絲較少，四周新生的菌絲為白色，菌落直徑達3.0 cm，中央出現隆起；培養3 d時，菌落圓形、致密，呈同心圓環狀向四周拓展，直徑達5.5 cm，綠色孢子布滿菌落，呈藍綠色，白色菌絲被覆蓋，培養基顏色無明顯變化，沒有明顯的滲出物，無明顯氣味。

圖3 ZJ2132菌種劃線接種形態

2.3.2 顯微鏡下的觀察（插片法） 菌種采用插片法進行制片，然后在顯微鏡下觀察，結果如圖4所示：菌種ZJ2132的菌絲為樹枝狀，非輪枝狀，有隔；分生孢子梗光滑、較粗，淡褐色；頂囊呈球形，淡綠色；小梗雙層、無色，分生孢子呈卵圓形。

圖4 ZJ2132鏡檢圖（油鏡100倍）

根據《真菌鑒定手冊》和《常見與常用真菌》中關于木霉屬的描述，實驗中菌落、菌絲及孢子等表現出的形態特征，將ZJ 2132菌株初步鑒定為木霉屬中的Trichoderma sp.。

3 結論

從土壤中采用剛果紅葡聚糖培養基對產生菌進行篩選，分離出9株透明圈直徑與菌落直徑之比>1.4的菌株；通過搖瓶復篩，確定了一株產β-葡聚糖酶酶活相對較高的菌株，命名為ZJ2132，其產酶活性為142.36 U/mL；通過對菌株ZJ2132的菌落和個體形態特征的觀察，初步確定該菌株ZJ2132為木霉屬中的Trichoderma sp.。該菌株酶活高于大多文獻報道的產β-葡聚糖酶酶活，因此極具應用開發價值。

[1]郭小權，胡國良，劉 妹.β-葡聚糖的抗營養作用及β-葡聚糖酶在飼料中的應用[J].江西飼料，2001（2）：11-13.

[2]張 潔、蔡敬民，吳 克，等.β-葡聚糖酶的研究與應用前景[J].安徽農業科學，2003，31（5）：893-896.

[3]李孝輝、錢玉英.大麥飼料的開發及β-葡聚糖酶的應用[J].糧食與飼料工業，1997，（8）：19-20.

[4]張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術[M].北京：高等教育出版社，1997.

[5]劉永舉，王清吉，王江青，等.DNS法測定飼用β-葡聚糖酶活力[J].中國飼料，1999，（18）：26-27.

[6]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

[7]中國科學院微生物研究所《常見與常用真菌》編寫組.常見與常用真菌[M].北京：科學出版社，1973.