固定化生姜蛋白酶的制備及其性質研究

安徽農業大學生命科學學院 崔松松 張 琛＊ 何孔泉 張 潔

生姜蛋白酶是從生姜中提取出的一種植物蛋白酶，作為一種新型植物蛋白酶 （孫國梁等，2007），生姜蛋白酶食用安全，且具有藥用保健價值，可用作食品添加劑，如嫩肉劑（吳巧玲，2001）和酒澄清劑、乳制品凝固劑等（唐曉珍等，2002），其應用前景廣泛。但是在實際應用中，游離的生姜蛋白酶對環境敏感、穩定性較差，易失活，反應后難以回收（刁恩杰和丁曉雯，2003）。通過對酶的固定化制備，可提高生姜蛋白酶的穩定性，拓展其應用范圍。

近年來固定化酶在各學科領域的研究異常活躍，并得到迅速發展和廣泛的應用。目前使用和研究中的固定化酶的方法和載體材料種類繁多，其中用海藻酸鈉固定化酶的優點是使用方法較為簡單，反應條件溫和，海藻酸鈉還具有無毒、不易被大多數微生物降解的優點（魯玉俠等，2007；張富新等，2005）；但海藻酸鈣凝膠具有不穩定、鈣離子易脫落、凝膠變軟甚至溶解等缺點，因此為了克服以上缺點（鄭婉玲等，1998），本研究選用以戊二醛為交聯劑制備海藻酸鈉固定化生姜蛋白酶 （王娜等，2009），以期來提高生姜蛋白酶的穩定性，同時為固定化生姜蛋白酶的進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及試劑 TD4低速自動平衡離心機，長沙平風儀器儀表有限公司；LXJ-ⅡB低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；KQ-400DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FA2024A電子天平，上海精密科學儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；752C型紫外分光光度計，南京第四分析儀器有限公司；考馬斯亮藍G-250、酪氨酸、三氯乙酸等均為國產試劑。

1.2 生姜蛋白酶的制備 生姜粉碎后，加入-20℃丙酮，抽干得粉末，再加適量的pH 6.0的磷酸緩沖液提取，離心，取上清液加入單寧使其濃度達0.12%，低溫離心，取沉淀物加入緩沖液定容，既為生姜蛋白酶粗酶液（唐曉珍等，2003）。

1.3 固定化酶的制備 取1 mL的溶液酶與2 mL的海藻酸鈉于注射器內混勻，然后用注射器將混合液滴入CaCl2溶液中硬化1 h，戊二醛溶液中交聯4 h，抽濾，所得的凝膠珠即為固定化酶。

1.4 酶活性的測定 取酶液1 mL，40℃條件下加入底物酪蛋白1 mL，混勻，反應20 min，加入3 mL三氯乙酸終止反應，取上清液在275 nm下測定OD值。固定化酶的酶活測定方法同上。

活力單位定義：一定條件下（pH 6.0，溫度為40℃）每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量。

1.5 固定化條件的優化

1.5.1 海藻酸鈉濃度的影響 戊二醛濃度為1%，CaCl2的濃度為3%，配制濃度為0.5%、1%、2%和3%的海藻酸鈉溶液。制備不同濃度海藻酸鈉的固定化酶。在275 nm下做酶活測定。

1.5.2 戊二醛濃度的影響 海藻酸鈉的濃度為2%，CaCl2的濃度為2%，配制濃度為0.5%、1%、2%、3%和4%戊二醛溶液。制備固定化酶并測其酶活。

1.5.3 CaCl2濃度的影響 海藻酸鈉的濃度固定為2%，戊二醛的濃度為1%，配制濃度為1%、2%、3%、4%和5%的CaCl2溶液。制備固定化酶并測定其酶活。

1.5.4 驗證試驗 海藻酸鈉濃度為2%，戊二醛濃度為3%，CaCl2濃度為2%，制備固定化生姜蛋白酶。40℃條件下反應20 min，275 nm下測其酶活。游離酶做同樣處理。

1.6 固定化酶的酶學性質

1.6.1 固定化酶和溶液酶最適溫度的測定 在優化條件下制備固定化酶，并分別在30、40、50、60、70℃條件下進行反應。溶液酶做同樣處理。

1.6.2 固定化酶和溶液酶的最適pH值的測定在優化條件下制備固定化酶，分別在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖液環境中進行反應。溶液酶做同樣處理。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度的影響 載體的濃度影響固定化酶的活性。海藻酸鈉濃度過低時載體與酶的固定不完全，易導致酶流失；海藻酸鈉濃度過高時海藻酸鈉的黏度過大，影響酶與底物反應，從而影響酶活性。根據測得的結果，由圖1可知海藻酸鈉的最適濃度為2%。

2.2 戊二醛濃度的影響 戊二醛是常用的交聯劑，其濃度較低時易導致酶與載體脫落，進而影響酶活性；其濃度過大時易導致戊二醛分子內發生交聯而影響酶活性，合適的戊二醛的濃度對固定化酶的活性影響最小，根據圖2的結果可知，戊二醛的最適濃度為3%。

圖2 戊二醛濃度對固定化酶活性的影響

2.3 CaCl2濃度的影響 CaCl2可與海藻酸鈉反應形成海藻酸鈣，CaCl2濃度的大小影響凝膠珠的機械強度。根據測得的結果，如圖3可知，當CaCl2的濃度為2%時固定化酶酶活性達到最大值。

圖3 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響

2.4 驗證試驗 在上述最優條件下，制備固定化生姜蛋白酶，測得固定化酶的酶活為53.48 U/g。

2.5 固定化酶與溶液酶的最適溫度 由圖4可知，兩者的最適溫度均為60℃。但固定化酶的相對酶活隨著溫度的改變，變化較為平緩，在較高溫度下，在70℃時保持96.13%的相對酶活，而游離酶其酶活變化幅度較為劇烈。這是因為固定化酶包埋海藻酸鈉這一外殼后，對溫度的變化沒有游離酶敏感，表現出較高的溫度穩定性。

圖4 游離酶與固定化酶的最適溫度

2.6 固定化酶與溶液酶的最適pH 圖5表明，固定化酶與溶液酶的最適pH值均為6.0。整個pH值量程中變化中，固定化酶曲線較為平緩，其相對酶活在不同pH值下仍保持80%以上，如pH值為3時固定化酶的相對酶活為80.07%，在pH值為7時酶活仍在93.4%，而游離酶的酶活隨著pH值的不同變化較大，在pH值為3時最低，其相對酶活只有37.97%，隨著pH值的升高，其酶活變化幅度劇烈，表現出受酸堿影響顯著，這是因為載體海藻酸鈉的性質不僅對固定化酶的酶活有影響，而且海藻酸鈉這一外殼還起保護作用，使酸堿因素對其影響較小，顯示出比游離酶更寬泛的適應性。

圖5 游離酶與固定化酶的最適pH

3 討論

生姜蛋白酶是一種較為新型的蛋白酶，但它的穩定性差，并且反應后游離酶和底物、產物難以分離，不利于循環使用，通過對酶固定化可以提高酶的穩定性和利用率。但是，固定化后酶分子由游離態變成固態，由于載體的影響，酶蛋白活性構象會發生變化，使得酶的活性中心受到限制，其次海藻酸鈉是甘露糖醛酸以β-1，4糖苷鍵相連接的多糖類物質，雖然是較為理想的載體，并且固定化方法較為簡單，但海藻酸鈣凝膠在含多價陰離子溶液以及高濃度電解質溶液中不穩定、鈣離子易脫落、凝膠變軟甚至溶解，因此通過利用以戊二醛為交聯劑的海藻酸鈣固定化酶，可使固定化酶在很長一段時間內保持活性而且能較大的提高穩定性能（王秀征等，2009）。本研究利用海藻酸鈉和戊二醛對生姜蛋白酶進行雙重固定，研究證實，生姜蛋白酶的固定化條件受到多個因素的影響，在海藻酸鈉的濃度為2%、戊二醛的濃度為3%、CaCl2的濃度為2%時，制備的固定化酶活力為53.48 U/g，與游離酶相比，固定化酶對溫度和酸堿顯示出更寬泛的適應性。雖然對固定化生姜蛋白酶的研究取得一定的結果，下一步的工作仍需對固定化的其他條件、固定化酶的穩定性等性質做進一步的探討，同時探索新的固定化方法，以及應用新的載體，以提高固定化酶的活性回收率，延長其半衰期，從而達到更加理想的使用效果。

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