柱前衍生高效液相色譜法測定乳與乳制品中羥脯氨酸的含量

北京市飼料監察所 魏秀蓮 丁美方 董穎超 楊定忠

皮革水解蛋白是利用皮革下腳料經水解而生成的蛋白質混合物，其主要成分為膠原蛋白。由于皮革下腳料中含有大量皮革糅制及染色過程中添加的重鉻酸鉀和重鉻酸鈉等有毒物質，因此用這種原料生產水解蛋白，皮革中的重鉻酸鉀和重鉻酸鈉自然就被帶入產品中。如果長期食用含有“皮革水解蛋白”的食物，“鉻”重金屬離子便會被人體吸收、積累、中毒，使人體關節疏松腫大，甚至造成兒童死亡。衛生部最新引發了《食品中可能違法添加的非食用物質名單（第二批）》，明令禁止在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白。皮革水解蛋白與三聚氰胺不同，是真正的蛋白質，因此若被添加到食品中，檢測難度高于三聚氰胺。皮革水解物主要添加的食品是乳與乳制品及含乳飲料，作用是增加蛋白質含量。由于羥脯氨酸具膠原蛋白的特有組分，其含量占膠原蛋白10%以上，而乳蛋白中不含此成分，因此通過測定樣品中的羥脯氨酸，則可以判斷樣品中是否添加了皮革水解蛋白。關于動物組織及其他相關產品中羥脯氨酸的液相檢測方法已有報道（崔勇等，2008；鄭家概等，2008；孫光臣和劉英芹，2004），而關于乳及乳制品中的羥脯氨酸的檢測，尚未見報道，本文建立了測定乳與乳制品中羥脯氨酸的柱前衍生高效液相色譜法（HPLC）。

1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；氮吹儀（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

羥脯氨酸對照品、正亮氨酸對照品、異硫氰酸苯酯（天津博納艾杰爾科技有限公司）；乙腈為色譜純（美國Honeywell公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agela Venusil-AA氨基酸分析專用色譜柱 （天津博納艾杰爾科技有限公司）；流動相A：稱取無水醋酸鈉 8.2 g，加水800 mL，溶解后用冰醋酸調pH至6.5，然后加水至 1000 mL，加乙腈 75 mL，混勻，用 0.45 μm 濾膜過濾；流動相B：80%乙腈（V/V）；梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速：1 mL/min；柱溫40℃；進樣量 50 μL。

表1 梯度洗脫程序表

2.2 溶液的配制 0.1 mol/L鹽酸溶液：量取8.3 mL濃鹽酸，加水稀釋至1000 mL。6 mol/L鹽酸溶液（含0.1%苯酚）：稱取苯0.1 g，加濃鹽酸50 mL和水50 mL溶解，混勻。12 mol/L鹽酸溶液（含0.1%苯酚）：稱取苯酚0.1 g，加濃鹽酸100 mL溶解，混勻。正亮氨酸內標溶液：稱取正亮氨酸約10 mg，加0.1 mol/L鹽酸溶液 10 mL使溶解，混勻。三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混勻。異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯25 μL，加乙腈2 mL，混勻。羥脯氨酸（C5H9NO3）標準儲備液 500 μg/mL:稱取 50.0 mg羥脯氨酸用0.1 mol/L鹽酸溶解并，定容至100mL容量瓶中。 標準工作液25 μg/mL:吸取標準儲備液5.00 mL置于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容至刻度，混勻，準確量取1.0 mL，置1.5 mL塑料離心管，準確加入正亮氨酸內標溶液 100 μL，混勻。

2.3 樣品水解 皮革蛋白粉的水解：準確稱取皮革蛋白粉10～20 mg，將稱好的樣品放于10～20 mL水解管中，加入5 mL含0.1%苯酚的6 mol/L鹽酸，振搖使樣品溶解或使樣品均勻分散于溶液中，將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min（或置-20℃冰箱中冷凍），用氮氣置換空氣后在充氮氣狀態下擰緊螺絲蓋，將已封口水解管放在(110±1)℃的恒溫干燥箱內，水解24 h，取出冷卻。打開水解管，將水解液全部轉移至25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容，混勻，過濾，取濾液，作為衍生用樣品溶液。

純牛奶和皮革奶的水解：準確稱取純牛奶和皮革奶約3 g，分別置于10～20 mL水解管中，每管加入3 mL濃鹽酸（含0.1%苯酚），將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min（或置-20℃冰箱中冷凍）。其余步驟同固體樣品水解過程。

2.4 樣品衍生 準確量取衍生用樣品溶液1.0 mL，置玻璃管中，準確加入正亮氨酸內標溶液100 μL，用真空干燥器在40～50℃真空干燥或用氮吹儀吹干除去鹽酸后，加1.1 mL 0.1 mol/L鹽溶液重新溶解，混勻，量取220 μL，置1.5 mL塑料離心管中，往離心管中加入三乙胺乙腈溶液100 μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液 100 μL，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷800 μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，用 0.45 μm 小濾器過濾，取濾液適量，用水稀釋5倍后上機分析。另取羥脯氨酸標準工作液220 μL，按上述方法衍生處理。

3 結果與討論

3.1 色譜行為及專屬性實驗 從圖1可以看出羥脯氨酸與其他氨基酸得到很好的分離，與前后氨基酸的分離度大于8.5，表明本方法具有良好的專屬性。

3.2 線性范圍及檢測下限 精密吸取羥脯氨酸標準儲備液適量，配制成羥脯氨酸濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.3125、0.078125 μg/mL的系列樣本， 按 2.4制備對照品溶液，并進行色譜分析，以羥脯氨酸峰面積（Y）對濃度 （X）進行線性回歸得Y=0.0317 X-0.5561（r＝1），以羥脯氨酸峰面積與內標峰面積的比值（Y）對濃度（X）的進行線性回歸得Y=101.87X-0.4124（r＝1），結果表明在 0.08 ～ 200 μg/mL 的濃度范圍內，羥脯氨酸的濃度與峰面積間具有良好的線性關系，相關系數r=1。羥脯氨酸的最低檢出限為 0.014 μg/mL（S/N=3），定量限為 0.046 μg/mL（S/N=10）。

圖1 19種氨基酸高效液相色譜圖

3.3 重復性實驗 取6.25 μg/mL的羥脯氨酸標準溶液衍生物重復進樣6次，保留時間及峰面積的RSD分別為0.07%和0.22%，表明該方法具有良好的重復性。

3.4 穩定性實驗 取6.25 μg/mL的羥脯氨酸標準溶液衍生物，按上述色譜條件分別在0、8、16、24、32、48 h測定，羥脯氨酸峰面積，內標物峰面積及羥脯氨酸峰面積與內標峰面積的比值的RSD分別為0.43%、0.06%、0.43%，結果表明羥脯氨酸衍生物具有較好的穩定性，至少可穩定48 h。

3.5 回收率實驗 分別取高 （50 μg/mL）、中（31.25 μg/mL）、低（12.5 μg/mL）三個濃度進行空白加樣回收實驗，回收率為98.2%～99.0%。結果見表2。

表2 回收率測定結果表

3.6 樣品測定 按上述水解、衍生化及色譜條件對皮革奶，皮革水解蛋白粉和市售純牛奶進行測定，測定結果見表3。

表3 樣品測定結果表

圖2 樣品高效液相色譜圖

4 討論與結論

本實驗建立了柱前衍生高效液相色譜法測定乳與乳制品中皮革水解蛋白特征性成分羥脯氨酸含量的方法，高中低濃度加樣回收范圍98.2% ～99.0%。此法簡單易行，準確度高，樣品中各氨基酸分離度好，乳、乳制品及皮革水解蛋白粉中內源性物質對羥脯氨酸含量測定沒干擾，適用于乳及乳制品中羥脯氨酸的測定。本方法通過對羥脯氨酸含量的測定，可判定乳與乳制品制品中是否添加了皮革水解蛋白，為皮革奶檢測提供實驗依據。

[1]崔勇，劉智，張博，等.反向高效液相色譜柱前衍生化法測定保健食品中羥脯氨酸的含量[J].中國衛生檢驗雜志，2008，18（11）：2247 ～ 2249.

[2]鄭家概，王飛，農云軍，等.柱前衍生高效液相色譜法對動物組織中膠原蛋白的測定[J].分析測試學報，2008，27（12）：1383 ～ 1385.

[3]孫廣臣，劉英芹.高壓液相色譜法測定腎臟組織羥脯氨酸含量[J].黑龍江醫藥科學，2004，27（5）：79 ～ 80.