胃癌手術(shù)前后外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及臨床意義

邱宇杰，侯計平，李富新，李衛(wèi)東

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普通外科，天津普通外科研究所，天津300052；2.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院普通外科，天津 301800）

世界范圍內(nèi)最常見惡性腫瘤中胃癌排第4名[1]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查表明，日本、美國的胃癌發(fā)病率今年呈持續(xù)下降趨勢，但我國仍屬于胃癌高發(fā)國家。目前，胃癌的治療以手術(shù)為主，但由于胃癌診斷時病期已偏晚，外科治療的療效不夠滿意。大量研究已表明惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，其中包括機體的免疫功能失衡，在此狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞監(jiān)控，發(fā)生免疫逃逸，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[2]。腫瘤的免疫內(nèi)環(huán)境在腫瘤的形成發(fā)展過程中起到關(guān)鍵性作用。因此闡明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與機體的免疫功能狀態(tài)的關(guān)系，可利于建立新的治療方法[3]。本研究目的旨在探索胃癌CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的變化特征及其與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，為新的治療方法提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 對象 在取得患者知情同意后，以天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普外科2007年10月至2009年4月期間初治行手術(shù)切除治療的胃癌患者共38例作為研究對象，其中男性26例，女性12例，年齡43～85歲，中位年齡為56.00歲，平均年齡（60.13±11.50）歲。收集每一例病人的臨床資料，所有切除標(biāo)本術(shù)后均得到病理學(xué)證實。同期隨機收集在我院進行體檢的健康者20例作為正常對照組，其中男性13例，女性7例，年齡40～78歲，中位年齡54.00歲，平均年齡（58.50±11.02）歲，并且所有受檢者外周血中生化和免疫指標(biāo)均正常。兩組間性別和年齡經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異（P>0.05），具有可比性。

1.2 材料 鼠抗人CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Per－CP、CD4-PerCP、CD25-FITC 單克隆抗體、紅細(xì)胞裂解液均為Becton Dickinson公司產(chǎn)品；4%多聚甲醛為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 免疫功能檢測 抽取胃癌組術(shù)前3 d、術(shù)后14 d以及正常對照組外周血，所有受試者外周血標(biāo)本均在清晨空腹下抽取，血液標(biāo)本均在抽血后6 h之內(nèi)處理。血標(biāo)本以CD4-PerCP、CD25-FITC單克隆抗體及CD4-FITC、CD8-PE、CD3-perCP單克隆抗體分別對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及CD3+CD4+CD8+T細(xì)胞亞群進行標(biāo)記并進行流式細(xì)胞學(xué)檢測。所有受試者未進行過影響機體免疫狀態(tài)的任何干預(yù)，包括放射治療、化療以及生物治療。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計分析軟件包處理。兩獨立樣本非參數(shù)檢驗應(yīng)用Mann-Whitney Test，兩相關(guān)樣本非參數(shù)檢驗應(yīng)用Wilcoxon one-sample方法，完全隨機設(shè)計多組樣本非參數(shù)檢驗比較應(yīng)用Kruskal-Wallis Test，描述兩樣本相關(guān)性應(yīng)用Spearman’s秩相關(guān)檢驗。檢驗水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者外周血Treg、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的表達

2.1.1 胃癌患者外周血Treg的表達 胃癌患者術(shù)前外周血Treg比例顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；手術(shù)后外周血Treg比例與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。胃癌患者術(shù)前外周血Treg比例顯著高于術(shù)后比例，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表 2）。

表1 胃癌患者手術(shù)前、后與對照組外周血Treg、CD4+T及CD8+T細(xì)胞比例的比較*Tab 1 Comparisons of Treg,CD4+T cell and CD8+T cell between gastric cancer patients of pre-and post-operation and control

表2 胃癌患者手術(shù)后與手術(shù)前外周血Treg、CD4+T及CD8+T細(xì)胞比例的比較*Tab 2 Comparisons of Treg,CD4+T cell and CD8+T cell between gastric cancer patient of pre-and post-operation

2.1.2 胃癌患者外周血CD4+T細(xì)胞的表達 胃癌患者術(shù)前外周血CD4+T細(xì)胞比例與正常對照組相比，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；胃癌患者術(shù)后外周血CD4+T細(xì)胞比例與對照組比較，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。胃癌患者術(shù)后外周血CD4+T細(xì)胞比例與術(shù)前比較，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表 2）。

2.1.3 胃癌患者外周血CD8+T細(xì)胞的表達 胃癌患者術(shù)前外周血CD8+T細(xì)胞比例明顯低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；胃癌患者術(shù)后外周血CD8+T細(xì)胞比例與正常對照組比較，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。胃癌患者術(shù)后外周血CD8+T細(xì)胞比例明顯高于術(shù)前，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

2.2 相關(guān)性分析

2.2.1 胃癌患者術(shù)前外周血Treg比例在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3），其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.521、0.533，P值均為0.001，與腫瘤浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度及病理類型均無相關(guān)性（P>0.05）。Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者外周血中Treg比例顯著高于Ⅰ期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.008），Ⅳ期胃癌患者外周血中Treg比例亦顯著高于Ⅱ期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.008），其它各分期之間胃癌患者外周血中Treg比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.008）。

2.2.2 胃癌術(shù)前術(shù)后外周血中Treg比例下降程度與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度、病理分型以及手術(shù)方式均無相關(guān)性（P>0.05）。

2.2.3 胃癌患者術(shù)前、術(shù)后外周血CD8+T細(xì)胞比例與Treg比例呈負(fù)相關(guān)（表4）。

表3 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同TNM分期之間胃癌患者術(shù)前外周血中Treg比例的比較Tab 3 Comparisons of Treg between different status of lymph node metastasis and TNM staging of gastric cancer patients

表4 胃癌患者手術(shù)前、后外周血Treg、CD8+T細(xì)胞比例的關(guān)系*Tab 4 Relationship between Treg and CD8+T cell of gastric cancerpatients of pre-operation and post-operation

3 討論

1995年，Sakaguchi等[4]首次分離獲得CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，Treg作用機制逐漸被闡明，其調(diào)節(jié)功能在機體免疫穩(wěn)態(tài)維持、移植耐受、腫瘤免疫、過敏反應(yīng)及微生物感染等方面均得到了證實。正常狀態(tài)下，Treg調(diào)節(jié)正在進行的免疫反應(yīng)和Treg的數(shù)量，預(yù)防自身免疫功能失調(diào)。其數(shù)量和功能的增高或減低，必然相應(yīng)地導(dǎo)致免疫抑制（例如腫瘤或感染）或自身免疫（例如多發(fā)性硬化癥）[5]。大量的研究已表明惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，其中包括機體的免疫功能失衡。近年研究發(fā)現(xiàn)，Treg在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤組織中均有增高，提示腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生一系列逃避抗腫瘤反應(yīng)的機制，腫瘤患者體內(nèi)Treg數(shù)量的增高即是抑制腫瘤免疫的機制之一，體外的試驗也表明Treg能夠抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，提示該類細(xì)胞可能為腫瘤細(xì)胞的生長提供一個良好的環(huán)境，促進腫瘤的發(fā)展。在此狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞監(jiān)控，發(fā)生免疫逃逸，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[2]。

Treg在機體內(nèi)維持一定的比例，在健康人外周血中能夠監(jiān)測到Treg，其比例可在一定程度上反映機體的免疫狀態(tài)。本文正常對照組結(jié)果為（4.56±3.03）%，該比例指的是其群細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的比例，和文獻報道相一致，可以作為深入研究的對照基礎(chǔ)。Anna等[6]研究了42例不同上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤患者及健康人外周血的CD4+CD25+Treg分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血的CD4+CD25+Treg均有升高，而健康對照組未見升高。Shah等[7]研究了40例宮頸癌標(biāo)本，CD4+CD25+Treg的高表達即意味著明顯下降的生存率。本文結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明，胃癌患者術(shù)前外周血中Treg比例顯著高于對照組（P<0.01），而術(shù)后外周血中Treg與對照組無顯著差異；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性胃癌患者術(shù)前外周血中Treg比例高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者（P<0.01）。胃癌患者外周血中Treg比例與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；各TNM分期之間胃癌患者術(shù)前外周血中Treg比例有顯著差異（P<0.05），進一步行各TNM分期之間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者術(shù)前外周血中Treg比例均較Ⅰ期顯著增加（P<0.008），Ⅳ期胃癌患者術(shù)前外周血中Treg比例亦顯著高于Ⅱ期（P<0.008），表明Treg比例的增高使機體產(chǎn)生腫瘤免疫耐受，抑制機體的抗腫瘤免疫，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Treg比例在一定程度上反映疾病的進展情況，甚至能作為檢測疾病進展的免疫學(xué)指標(biāo)。

本文結(jié)果顯示胃癌患者術(shù)前外周血中CD4+T細(xì)胞比例與對照組無顯著差異（P>0.05），說明CD4+T細(xì)胞不是影響腫瘤免疫的主要因素，而是其亞群Treg細(xì)胞參與腫瘤的免疫耐受，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。另一方面，胃癌患者術(shù)前外周血中CD8+T細(xì)胞比例明顯降低，且胃癌患者術(shù)前外周血CD8+T細(xì)胞比例與Treg比例呈負(fù)相關(guān)，術(shù)后外周血CD8+T細(xì)胞比例與Treg比例亦呈負(fù)相關(guān)，即隨著Treg比例的升高，CD8+T細(xì)胞比例下降。CD8+T細(xì)胞是主要的腫瘤免疫作用細(xì)胞之一，而腫瘤患者的這種細(xì)胞往往功能低下數(shù)量減少。提示Treg通過抑制CD8+T細(xì)胞的增殖以及抑制CD8+T細(xì)胞對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，從而能夠促進癌細(xì)胞的生長和進展。Li等[8]利用抗CD25抗體去除小鼠體內(nèi)的Treg，實驗結(jié)果顯示Treg數(shù)量減少達到90%以上時可誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)的一系列過程，其中包括腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的激活以及浸潤腫瘤的CD8+T細(xì)胞數(shù)量的增多。

本文結(jié)果顯示胃癌患者外周血中Treg比例及其變化在不同腫瘤浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度及病理類型間無顯著差異，這一結(jié)果說明以上情況不是影響胃癌患者Treg比例的主要因素。胃癌術(shù)前術(shù)后外周血中CD4+CD25+Treg比例差值在不同浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外，根治性手術(shù)胃癌患者術(shù)前術(shù)后外周血中CD4+CD25+Treg比例差值與姑息性手術(shù)比較，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這提示無論腫瘤分期、分化程度、組織類型、原發(fā)灶深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況如何，能否行根治性手術(shù)，只要去除腫瘤本身，就可以使外周血中CD4+CD25+Treg比例下降。這也從另一方面闡明切除腫瘤有助于CD4+CD25+Treg比例下降，從而改善機體的抗腫瘤免疫能力。

本文結(jié)果提示Treg可能通過抑制CD8+T細(xì)胞的增殖及功能，促進腫瘤細(xì)胞的生長和發(fā)展，這可能是腫瘤患者免疫功能受到抑制的機制之一。去除腫瘤本身，Treg比例顯著降低，可以改善機體的抗腫瘤免疫能力，也說明了腫瘤本身在Treg細(xì)胞生成、增殖及聚集過程中起著重要作用。實驗結(jié)果顯示Treg與腫瘤的侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Treg在一定程度上可作為檢測疾病進展的免疫學(xué)指標(biāo)。

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