胃癌前病變組織中人端粒酶逆轉錄酶、p53蛋白的表達與幽門螺桿菌的關系

劉 芳 ，房 青 ，關 劼 ★，李紅艷 ，徐 波

（1.中日友好醫院 消化內科；2.中日友好臨床醫學研究所 病理生理室，北京 100029）

胃癌的發生發展是多階段、多步驟的過程，有多種因素參與。大多數學者認為胃癌可能是幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp） 長期感染與其它因素共同作用的結果。端粒酶和p53的表達被認為和大多數惡性腫瘤的發生密切相關，端粒酶已被認為是胃癌臨床診斷的良好指標。有關p53表達和Hp感染關系的研究不少，但研究結論不一致。本課題通過檢測胃癌前病變患者的胃粘膜組織中人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA、p53 蛋 白 的 表 達 和Hp感染狀況，分析它們的相關性，旨在探討Hp感染對胃粘膜病變的作用機制。

1 材料和方法

1.1 樣品收集

對2004年～2006年間在我院就診的患者于2007年～2010年再次進行胃鏡追蹤隨訪，均于胃竇處提取組織2塊，共隨訪60例，平均隨訪時間為2年。其中Hp根除者26例 （腸上皮化生16例，慢性淺表性胃炎10例），未根除者10例（腸上皮化生6例，慢性淺表性胃炎4例）；對照組為持續陰性者24例（腸上皮化生11例，慢性淺表性胃炎13例）。治療方案：①Hp根除方案：奧美拉唑（20mg，2 次 ／d）、阿莫西林克拉維酸鉀片（1.125g，2 次／d）、 克拉霉素 （0.5g，2 次 ／d）、 膠體果膠鉍（200mg，3/d），療程 10d，對青霉素過敏者將阿莫西林克拉維酸鉀替換為利復星 （0.2g，2次／d）；②對照組用胃粘膜保護劑治療。所有患者在首次胃鏡檢查前1個月內均未接受抑酸或抗生素治療，在治療結束停藥1個月后復查胃鏡。

1.2 試劑

采用Warthin-Starry改良銀染法檢測胃粘膜組織中Hp感染，采用實時定量RT-PCR分析胃粘膜組織中端粒酶表達水平，所需Trizol試劑、SYBR Green ER試劑盒購自美國Invitrogen公司 。 靶 序 列 ：hTERTF：5'-Cgg，AAg，AgT，gTC，Tgg， AgC，AA-3'，hTERTR；5'-ggA，TgA，AgC，ggA， gTC，Tgg，A-3'。 內對照物：β-actinF （5'－TCT ACG AGG GCT ATG CTC TCC-3'）；β-actinR（5'－GGA TGC CAC AGG ATT CCA TAC-3'）。

1.3 方法

1.3.1 Hp感染檢測

采用Warthin-Starry改良銀染法檢測胃粘膜組織中Hp感染情況，顯微鏡下見到典型的短棒狀或螺旋狀棕黑色顆粒判為Hp陽性。根據銀染的數量，＜10%為陰性 （-），10%～50%為弱陽性（+），50%～75%為中等陽性（++），≥75% 為強陽性（+++）。

1.3.2 端粒酶hTERT表達水平的檢測

采用實時熒光定量RT-PCR方法檢測胃粘膜組織中hTERT mRNA表達水平，用Trizol試劑按標準程序提取組織總RNA，將組織塊在研缽中加入液氮研磨成粉末，按50～100mg組織加入1ml Trizol試劑，轉移到2ml離心管中，加入 200μl氯仿，離心后吸取上層水相，異丙醇沉淀后，75%乙醇洗2次，用DEPC水溶解RNA沉淀。

用SYBR Green ER試劑盒中的逆轉錄酶將1μg RNA逆轉錄成cDNA，取50ng cDNA加入PCR擴增預混液中，在ABI 7700實時定量PCR儀上進行hTERT定量分析，條件為95℃融解15s，60℃退火/延伸 45s，共 40 個循環。 以 GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）為內參照。

將hTERT與GAPDH拷貝數之比的100倍作 為 標 準 化 hTERT （normalizedhTERT，NhTERT），即：NhTERT=（hTERT/GAPDH）×100。

1.3.3 p53蛋白的檢測

免疫組化檢測p53蛋白的表達采用鏈霉素親生物素——過氧化酶聯接法（SP法），常規固定、切片，染色，設立陽性和陰性對照。選取具有適當形態學特征的細胞用于評估。高倍鏡下選擇5個代表性視野計數，胞核呈棕黃色的平均陽性細胞數＞5%判斷為陽性，＜5%為陰性。

1.4 統計學分析

采用SPSS16.0統計分析軟件處理數據，多組計量資料的比較采用t檢驗。計算Pearson相關系數和檢驗，用SPSS 11.5統計軟件包進行處理。

2 結果

Hp陽性患者共36例，Hp陰性患者共24例。表1示，hTERT及p53蛋白的表達水平在Hp陽性患者中顯著高于Hp陰性患者。

表2示，Hp根除者治療后hTERT與治療前相比顯著下降 （P＜0.05），Hp根除組 hTERT與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）；未根除者與對照組上述指標均無顯著性差異（均P＞0.05）。

表1 治療后Hp陽性和陰性組的hTERT mRNA表達水平

表2 Hp根除前后hTERT mRNA表達的變化

3 討論

端粒酶活性與惡性腫瘤的發展有密切關系，人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）的活性，使細胞不能滅亡，從而導致腫瘤的發生[1]。

p53基因的變異和hTERT基因的激活在胃癌的增殖和惡化中起到關鍵的作用[2]。王國安等[3]研究顯示hTERT表達率在萎縮性胃炎、腸化生、異型增生和胃癌等不同粘膜癌變過程中呈遞增趨勢。Hp感染為胃癌的發病因素之一已得到共識，Hp具體的致癌機制目前仍不清楚。Hp感染與端粒酶活性之間的關系是目前的研究熱點，Kashima等[4]在Hp感染與端粒酶活性關系的研究中發現，正常胃粘膜中無端粒酶活性表達，胃癌組織端粒酶活性明顯升高為83.3%；Hp陽性組胃粘膜端粒酶活性為50.7%，明顯高于Hp陰性組17.2%（P＜0.01），根除 Hp 后端粒酶活性（40.0%，4/10）明顯低于根除治療前（90.0%，9/10）（P＜0.05），認為Hp陽性胃疾病端粒酶活性增強，根除Hp后端粒酶活性明顯低于根除治療前。本研究表明，Hp陽性組hTERT表達明顯增高于Hp陰性組，提示端粒酶活性在胃癌前病變階段已經發揮作用。朱亞杰等[5]研究發現，p53蛋白轉錄調控活性的變化在胃癌的發生發展中起著重要的作用，p53突變可以影響其轉錄調控活。本研究表明，Hp陽性組p53蛋白表達明顯增高于Hp陰性組，隨著Hp的根除治療表達有明顯降低，提示p53蛋白與Hp感染有關系。國外已有研究對癌癥患者手術、化療或放療前后組織中和血漿中的hTERT mRNA進行實時定量檢測，可指導診治及評估預后。利用hTERT基因進行靶向性基因治療也是目前國內外研究的熱點[6]。

Hu等[7]將胃粘膜腸上皮化生伴 Hp感染和腸上皮化生不伴Hp感染分2組，用Trap法測定其端粒酶活性，結果顯示腸上皮化生伴 Hp感染端粒酶活性高于不伴Hp感染的腸上皮化生，且有顯著性差異。本研究表明Hp陽性組患者的端粒酶活性定量高于Hp陰性組，根除后明顯降低。提示Hp感染是胃粘膜上皮端粒酶激活的主要機制之一。Hp誘導的粘膜增殖可能涉及多個不同水平的調控環節。研究表明在胃癌演變的初始階段，Hp 可能導致 TNF、iNOS、CD95、Fas受體表達和capase活化，進而增強P27蛋白表達，使Rb蛋白絲氨酸殘基磷酸化減少，細胞周期蛋白E相關CDK2激酶活性顯著降低，進而細胞分化G1、S期被抑制，從而誘導細胞凋亡[8]。Yan等[9]研究認為在p53基因發生突變的細胞系MKN28中p53蛋白轉錄活性最低，進一步提示p53突變可以影響其轉錄調控。因此，深入探討Hp與端粒酶及p53蛋白的關系及機制對胃癌的防治具有重要意義。

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