紫蘇DNA導入對煙葉中蘆丁含量的影響*

魏克強，楊俊仙，魏治中

(1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西大學經濟與工商管理學院，山西 太原 030006；3.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801)

蘆丁(Rutin)，又名蕓香苷(Rutinoside)，是重要的黃酮類多酚生物活性物質，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、降低毛細血管通透性等作用，被廣泛用于醫藥、保健食品和化妝品中，開發利用價值很高。在自然界中蘆丁的含量十分豐富，尤以蕓香科植物蕓香草Cymbopogondistans(Needs) W.wats、豆科植物國槐SophorajaponicaL.、蓼科植物蕎麥FagopyrumesculentumMoench、金絲桃科植物紅旱蓮HypericumascyronL.等含量較高。目前，我國蘆丁的生產主要以槐米(槐花的花蕾)為原料進行提取[1]。

煙草中存在多種酚類物質，特別是烤煙中含有較高的蘆丁和綠原酸，其含量可占總酚量的75 %～95 %[2]，在煙草的生長發育、調制特性、煙葉色澤、煙氣香吃味和煙氣生理強度等方面起著重要作用，而且與煙草制品的等級呈正相關，多酚類物質含量高的卷煙等級越高[3]。我國是煙草種植和生產大國，其種植面積和產量均居世界首位。但是，在煙草種植和加工過程中，產生的廢次煙葉約占煙葉總產量的30 %左右，絕大部分作為廢物被丟棄，造成了嚴重的資源浪費和環境污染。不同類型煙草中多酚類物質的含量存在較大的差異，烤煙中含量最高，可達7 %，晾曬煙中的含量僅占0.5 %左右[3]。本研究將藥用植物紫蘇DNA導入普通煙草中，探討其對煙葉中蘆丁含量的影響，對改善煙草制品的品質具有重要意義，并為大量提取蘆丁提供新的原料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供體為藥用植物紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt，種子由中國醫學科學院藥用植物研究所提供；受體為普通煙草NicotianatobacumL.品種78-04(為山西農業大學培育的烤煙品系)，以及被選育出的雜種后代穩定品系(命名為紫蘇煙，Zisu tobacco)、野生種林煙草N.sylvestris，種子均由山西農業大學煙草育種研究室提供。

1.2 試驗儀器

Dionex Summit 高效液相色譜系統 (美國Dionex)，170U可見-紫外檢測器。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫蘇DNA導入煙草的方法 試驗在山西農業大學農學院溫室進行。采取先嫁接再有性雜交的方法，并選擇適宜的授粉環境。取一株野生種林煙草煙苗，于地面以上8～10 cm 處切斷，再從橫截面中心向下順直劈切接口作為砧木；另切取做受體的普通煙草78-04煙苗幼莖為接穗，使砧、穗緊密結合后，立即用塑料薄膜綁緊接口處以利保濕，使之愈合成為一株獨立的煙苗(圖1)。將嫁接的煙苗遮蔭以避免陽光直射，澆足水并加強管理。在開花期的早晨或傍晚采集供體紫蘇的花粉，授于去了雄蕊的接穗煙草78-04的柱頭上，然后套袋。紫蘇DNA導入煙草的效果以單株結果數、蒴果種子粒數、千粒質量等指標綜合評定。

圖1 嫁接后生長的煙草植株(箭頭所示為嫁接處)

1.3.2 煙葉中蘆丁含量的測定 試驗材料栽培于山西農業大學農學院試驗田，待煙草成熟采收烘烤后，依據GB2635-92(烤煙)的分級方法，取中部葉C3F 0.5 kg，由吉林大學基礎醫學院采用高效液相色譜法檢測煙葉中的蘆丁含量[2]。另取78-04煙葉及開花期的紫蘇葉作為對照。

2 結果與分析

2.1 無性嫁接與有性雜交相結合對紫蘇DNA導入煙草的影響

本研究由于選擇了適宜的砧木(林煙草)，嫁接的煙苗對環境具有較強的適應性，同時做接穗的煙苗(78-04)與砧木并非有性雜交，其遺傳性狀比較穩定。通過嫁接利用砧木影響接穗的營養代謝條件，促進雌蕊接受花粉的代謝作用，先嫁接再進行有性雜交，其單果種子粒數明顯增加，千粒質量一般達到0.08 g ；而對于非嫁接直接授粉的方法，其單果種子飽滿度較差，全為秕子。說明該方法有利于供體與受體基因間的漸滲和交流，能夠明顯提高外源DNA導入煙草的成功率，增加后代蒴果中的種子數量及千粒質量，如果結合回交，則能更顯著地提高外源DNA導入的成功率(表1)。

2.2 授粉環境對紫蘇DNA導入煙草的影響

結果表明，在早晨或傍晚溫度較低(22～25 ℃)、相對濕度較大(70 %～80 %)的環境條件下，紫蘇DNA導入煙草的成功率較高(表2)。可見，選擇低溫、高相對濕度的環境進行人工授粉是紫蘇DNA成功導入煙草的重要條件之一。

表1 嫁接后有性雜交對紫蘇DNA導入煙草的影響

表2 不同溫度、相對濕度對紫蘇DNA導入煙草的影響1)

1)材料為(林煙草 + 78-04)× 紫蘇

2.3 紫蘇DNA導入對煙葉中蘆丁含量的影響

葉片分析結果顯示(表3)，在導入后代穩定品系紫蘇煙中蘆丁的含量比受體普通煙草品種78-04提高了70.4 %；并且比我國主要產區槐米的蘆丁含量(0.278～0.365 mg/g)高4～5倍[4]。

表3 紫蘇煙葉中蘆丁含量的測定

1)以100 g煙葉計

3 討 論

我國藥用植物資源豐富，國內已有利用外源藥用植物基因導入異科植物方面的研究，但迄今獲得成功的報道僅有幾例：通過復態導入法將水稻Oryzasativassp.japonica品種通育211與柳葉菜科植物月見草OenotherabiennisL.進行遠緣雜交，獲得了具有育種價值的水稻新種質[5]；或采用原生質體融合法獲得了葡萄VitisviniferaL.與傘形科植物狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld 的再生雜種植株[6]；或利用無性嫁接和有性雜交相結合的創新育種方法分別將普通煙草NicotianatabacumL.品種與唇形科植物羅勒OcimumbailicumL.或紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt.遠緣雜交，選育出了具有較高工業利用價值的新型煙草穩定品系[7-8]。遠緣雜交的最終目的是導入外源基因并能正確表達。由于常規有性雜交育種難以克服遠緣植物間的不親合性，多采用基因操作的方法轉移異源的有益基因。而采取先嫁接再有性雜交的方法，能夠促使藥用植物與普通煙草基因間的漸滲、交流以及重組。經同工酶譜及分子鑒定，后代中含有藥用植物的外源基因[8]。可見，這是提高導入外源基因成功率的有效方法之一，也為開發利用藥用植物基因資源提供了一條新的途徑。

蘆丁是由已糖或戊糖與多酚槲皮素組成的黃酮類化合物，具有多方面的生物活性，主要存在于豆科植物槐SophorajaponicaL.的花蕾(槐花米)、果實(槐角)中，也是煙草中含量較高的酚類物質之一，對煙草及其制品的品質具有重要影響，其含量因煙草類型和品種而不同。但是由于槐米資源不足，目前我國蘆丁的生產還不能充分滿足市場需求。以紫蘇為供體、普通煙草為受體的雜種后代，可以大幅度提高煙葉中蘆丁的含量，這為提取寶貴的蘆丁原料提供了新的來源。研究表明，植物體內次生代謝物質的合成是受細胞內部相關基因調控的一系列復雜的生化反應過程。蘆丁是一種黃酮類次生代謝產物，是否由于轉入的紫蘇DNA導致煙草與紫蘇基因互作，進而對次生代謝物的合成途徑進行了調控，這些深層次的機制問題還有待于深入研究。

參考文獻：

[1]黃漢昌，張艾，姜招峰.槐米中蘆丁的提取及其與人血清白蛋白熒光光譜研究[J].北京聯合大學學報：自然科學版，2008，22(4):11-14.

[2]楊虹琦，周冀衡，邵巖，等.不同產地烤煙葉中綠原酸和蕓香苷的含量分析[J].天然產物研究與開發，2006，l8(4)：670-673.

[3]李力，楊涓，戴亞，等.烤煙中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的分布研究[J].中國煙草學報，2008，14(4)：13-17.

[4]李培凡, 張韻慧, 肖莉,等.RP-HPLC 法測定不同產地槐米中蘆丁[J].中草藥，2006，37(9)：1419-1420.

[5]初秀成,趙基洪,柴楊, 等.水稻與異科植物月見草遠緣雜交[J].農業生物技術學報, 2008，16(2)：320-325.

[6]宋錫全，夏光敏，周愛芬，等.葡萄與柴胡科間體細胞雜交再生雜種植株[J].科學通報,1999，44 (17)：1832-1836.

[7]魏克強,楊俊仙, 魏治中.新型煙草化學成分及醫藥成分的初步分析[J].天然產物研究與開發，2008，20 (4)：652-656.

[8]魏治中，魏克強.煙草遠緣雜交育種[M].北京：中國農業科學技術出版社，2008：53-58.