基因芯片法監(jiān)測(cè)粵東地區(qū)婦女人乳頭瘤病毒①

方裕森， 肖亮生， 翁雪芬， 林美珊

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科， 廣東 汕頭 515031 2.廣東省汕頭市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科， 廣東 汕頭 515031 3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 廣東 汕頭 515041)

宮頸癌與人乳頭瘤病毒HPV(Human papiloma virus)感染密切相關(guān)，從宮頸上皮不典型增生到浸潤(rùn)癌是一個(gè)持續(xù)發(fā)生、發(fā)展過程，大約需10年時(shí)間。HPV感染是一種廣泛流行性性傳播疾病，具有很強(qiáng)的地域性，同時(shí)也因?yàn)闄z測(cè)方法及受檢人群不同而顯示不同感染率及感染類型。本研究采用HPV－DNA芯片技術(shù)，對(duì)粵東地區(qū)婦女HPV感染率及其亞型的分布的調(diào)查，較準(zhǔn)確反映本地區(qū)感染率及其型別的分布，有利于建立和完善粵東地區(qū)婦女的HPV監(jiān)測(cè)體系;能及早發(fā)現(xiàn)高危人群，制定定期篩查時(shí)間;有利于早期診斷，以便對(duì)癌前病變積極處理 ，阻斷病程進(jìn)展，預(yù)防子宮頸癌(特別是浸潤(rùn)癌)的發(fā)生。宮頸癌發(fā)生的必要條件是高危型HPV的持續(xù)感染，至今已經(jīng)分離鑒定出超過200種HPV病毒的亞型，其中有20多種可感染生殖道上皮。文獻(xiàn)報(bào)道HPV病毒感染與70%的浸潤(rùn)性宮頸癌有關(guān)，以HPV16型和HPV18型最常見?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過研究已經(jīng)確認(rèn)，HPV陰性者幾乎不會(huì)發(fā)生宮頸癌;99.8%的宮頸癌患者中可以檢測(cè)到不同型別的HPV－DNA。子宮頸癌是目前所有癌癥中，唯一病因明確、能有效預(yù)防、早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)、并且能早期治療的癌癥。本文旨在通過用基因芯片了解粵東地區(qū)婦女HPV感染率及亞型分布情況，有利于建立和完善粵東地區(qū)婦女的HPV監(jiān)測(cè)體系也為宮頸癌疫苗的研發(fā)提供數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象：2009年4月至2010年5月，年齡16－80周歲，在廣東省汕頭市中心醫(yī)院就診的2122例婦女;在廣東省汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院就診的1182例婦女(包括汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院28例)，剔除二次復(fù)查的數(shù)據(jù)。

1.2 樣本采集：分別用廣東凱普生物科技有限公司及亞能生物公司提供的專用HPV取樣器，插入子宮頸外口，順時(shí)針或逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)5圈，慢慢取出取樣器放入含有保存液的小瓶中，粘貼患者條碼，隨后送實(shí)驗(yàn)室保存于4℃冰箱中，一周內(nèi)完成檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 凱普試劑：采用凱普人乳頭狀瘤病毒核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行HPV－DNA分型檢測(cè)，以導(dǎo)流雜交技術(shù)(HybriMax)平臺(tái)，一次可以檢測(cè)共21種HPV基因型;包括 14種高危型：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68 等;7種低危型：HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV 53和HPVcp8304等。實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果判斷嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行：①樣本DNA分離提?。何〖?xì)胞懸液樣本500－800μL，離心1 min(14000 rpm)吸棄上清，然后按照DNA提取試劑盒的步驟提取DNA。②PCR擴(kuò)增：采用PE 9600進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)處理：20℃10min;DNA變性：95℃ 9 min;擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)：95℃20 s→55℃30s→72℃30 s;延伸 5min ：72℃。③核酸分子快速導(dǎo)流雜交：取PCR產(chǎn)物加入檢測(cè)孔內(nèi)(95℃變性9 min→冰浴2 min);導(dǎo)流雜交(10min);封閉(封阻液);酶標(biāo)顯色。④結(jié)果判斷：肉眼觀察，按芯片上HPV亞型分布相應(yīng)著色點(diǎn)位判斷結(jié)果，陽性點(diǎn)呈藍(lán)紫色圓點(diǎn)，有兩個(gè)及兩個(gè)以上圓點(diǎn)陽性屬多重感染。⑤質(zhì)控：每次實(shí)驗(yàn)必須具備反應(yīng)質(zhì)控點(diǎn)、雜交顯色質(zhì)控點(diǎn)、陽性對(duì)照點(diǎn)和陰性對(duì)照點(diǎn)同時(shí)在控;每張芯片設(shè)有反應(yīng)質(zhì)控點(diǎn)和雜交顯色質(zhì)控點(diǎn)各一個(gè)。

1.3.2 亞能試劑

1.3.2.1 檢驗(yàn)方法：①提取 HPV －DNA：充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干。把1mL洗脫液全部轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，離心10min(13000rpm)，棄去上清液，保留管底的細(xì)胞沉淀。加入裂解液(50uL)懸浮沉淀，沸水浴加熱10min，離心10min(13000rpm)，保留上清液待用。②PCR擴(kuò)增：在PCR反應(yīng)管蓋上做好標(biāo)記，低速離心數(shù)秒，分別加入已提取的待測(cè)樣本DNA 5uL，反應(yīng)總體系為25uL，最后加入1滴礦物油，低速離心數(shù)秒。每次實(shí)驗(yàn)可設(shè)置一個(gè)陰性質(zhì)控和一個(gè)陽性質(zhì)控，作為產(chǎn)品使用的質(zhì)量控制。③雜交：取15mL塑料離心管，放入標(biāo)有樣本編號(hào)的膜條，加入A液(5－6mL)及所有(25uL)的PCR產(chǎn)物;為避免加熱時(shí)管蓋爆開，應(yīng)將管蓋擰緊，再將管蓋稍擰松;將離心管放入沸水浴中加熱10min，取出，擰緊管蓋，放入雜交箱51℃ 雜交至少1.5h。取50mL塑料離心管，加入B液(50mL)，于雜交箱或水浴箱中預(yù)熱至51℃。陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品同步處理。④洗膜：取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50mL離心管中，于51℃ 輕搖洗滌5min。⑤顯色：按A液：POD=2000：1配制孵育液，室溫輕搖孵育液30min，棄去孵育液。用A液室溫輕搖洗兩次，每次5min。用C液室溫洗膜1－2min，用時(shí)配置顯色液。將膜條浸泡于顯色液中避光顯色至少30min后，移至去離子水中浸泡即可觀察結(jié)果。

1.3.2.2 結(jié)果判定：實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效的前提：實(shí)驗(yàn)每張膜條在PC位點(diǎn)必須出現(xiàn)藍(lán)色顯色信號(hào);陰性質(zhì)控品除PC位點(diǎn)出現(xiàn)顯色信號(hào)外其余位點(diǎn)均不出現(xiàn)顯色信號(hào);陽性質(zhì)控品除PC位點(diǎn)出現(xiàn)顯色信號(hào)外，必須在相應(yīng)HPV基因型位點(diǎn)出現(xiàn)顯色信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 在中心醫(yī)院2122例篩查樣本中，陽性樣本523例，總陽性率為24.7%;前十種分型檢出率見表1。

表1 中心醫(yī)院523例陽性樣本中各分型比例

2.2 在附二院1182例篩查樣本中，陽性樣本351例，總陽性率為29.7%;前十種分型檢出率見表2。

表2 附二院351例陽性樣本中各分型比例

2.3 聯(lián)合統(tǒng)計(jì)前三種分型檢出率依次分別為：HPV16(205/874)、HPV 52(188/874)、HPV 58(118/874);分別占陽性樣本的比例為：23.5%、21.5%、13.5%。

3 討論

HPV是一種小的雙鏈DNA病毒，在不同國(guó)家、地區(qū)HPV感染率及其型別存在差異，與尖銳濕疣、宮頸癌相關(guān)的型別也不盡相同。HPV感染率及其型別檢測(cè)可提高子宮頸癌前病變篩查的敏感性。有研究表明宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二位婦女常見惡性腫瘤，高危型HPV的持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌的主要病因，宮頸HPV感染若不及時(shí)治療，約30%患者可發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)，CIN作為癌前病變，有20%可發(fā)展為宮頸癌。

肖亮生等對(duì)粵東地區(qū)婦女人乳頭瘤病毒的篩查與分析，總陽性率為 24.7%［1］。

本文篩查結(jié)果顯示，粵東地區(qū)婦女人乳頭瘤病毒的主要高危亞型HPV是HPV16、HPV52、HPV58，感染率分別為 23.5%、21.5%、13.5%，這與國(guó)內(nèi)有些地區(qū)報(bào)道以HPV16型最常見，其次為18型等有所不同，提示HPV的地域感染的差異性。

在宮頸癌患者中，F(xiàn)errera A［2］等的國(guó)內(nèi)外報(bào)道主要感染亞型是HPV16和HPV18亞型。

人乳頭瘤病毒是一種嗜上皮性病毒，性接觸是其傳播的主要途經(jīng);HPV感染多為短暫性感染，大多數(shù)在2年內(nèi)消失，自然清除時(shí)間約為7 －12個(gè)月［3］。

目前現(xiàn)已上市的 HPV預(yù)防疫苗具有“型特異性”，僅對(duì)預(yù)防HPV－16和18型2種高危型的HPV感染有效。而不同HPV亞型對(duì)不同種族人群致癌性的強(qiáng)弱也明顯不同。而HPV型別分布存在明顯的地區(qū)差異，國(guó)內(nèi)外的研究指出，宮頸癌發(fā)病率和HPV感染率存在著地區(qū)差異，在同一國(guó)家內(nèi)地區(qū)的分布也有所不同［4］。我國(guó)目前尚缺乏系統(tǒng)的、全面的、科學(xué)的HPV型別地區(qū)分布情況數(shù)據(jù)，HPV型別檢測(cè)可為我國(guó)的HPV疫苗研究提供數(shù)據(jù)資料，對(duì)我國(guó)預(yù)防性宮頸癌疫苗的研發(fā)有指導(dǎo)作用［5］。

明確一個(gè)地區(qū)HPV流行的主要型別，對(duì)于評(píng)估患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床制定合理的治療方案也具有重要意義。本文篩查結(jié)果對(duì)建立和完善粵東地區(qū)婦女的HPV監(jiān)測(cè)體系有重要意義。隨著各種普查的開展，高危型HPV型別檢測(cè)率的提高，以及HPV疫苗的問世，對(duì)宮頸癌的防治有重要意義。

［1］肖亮生，陳樂川，鄭映玉，等.粵東地區(qū)婦女人乳頭瘤病毒的篩查與分析［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(14)：1848－1849.

［2］Ferrera A ，Velema J P，F(xiàn)igueroa M ，et al.Human papillomavirus infection，cervical dysplasia and invasive cervical cancer in Honduras：a case － control study［J］.Int Cancer，1999，82(6) ：7991.

［3］劉筑玉，李建梅，范燕紅，等.432例HPV檢測(cè)結(jié)果和宮頸病變的關(guān)系分析［J］.中國(guó)婦幼保健，2009，24(14)，1919－1920.

［4］錢建華，謝幸，葉大風(fēng).子宮頸HPV感染的流行病學(xué)特征［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2003，38(11) ：712.

［5］王曉靜，劉玉玲.HPV分型檢測(cè)在宮頸癌前病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2008，29(7)：29 －30.