負壓創(chuàng)面治療技術早期應用對軟組織爆炸傷創(chuàng)面作用的研究

錢玉鑫 蘆立軒 侯強 江華 張文俊 劉安堂

爆炸傷導致軟組織缺損嚴重，傷道周圍及深面存有泥沙、爆炸物碎屑、毛發(fā)等異物，清創(chuàng)后感染發(fā)生率高[1]；爆炸傷患者嚴重創(chuàng)傷后免疫反應受到抑制，容易出現嚴重感染及其他并發(fā)癥[2]。負壓創(chuàng)面治療技術(NPWT)自上世紀90年代以來，已被證實具有較強的預防和控制感染能力，并能促進肉芽生長。本研究通過動態(tài)觀察組織內細菌量及組織學觀察肉芽生長情況，探討NPWT早期應用對于控制軟組織爆炸傷創(chuàng)面感染及促進肉芽生長的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

健康家豬(n=5)，第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所動物中心提供，體質量30～35 Kg，雌雄不限；NPWT敷料由醫(yī)用聚氨酯海綿(孔徑400～600 μm，厚度2 cm，大小10 cm×15 cm)、三通接頭(GL-200)、引流管醫(yī)用貼膜(3M)、負壓泵(YB-DX230型電動吸引器，上海醫(yī)療器械工業(yè)公司)構成。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬軟組織爆炸傷模型建立

采用兩根600 mg瞬發(fā)紙質電雷管并列致傷，間距2 cm。皮膚與爆炸源之間墊放0.5 cm厚海綿，固定后人員撤離，電起爆致傷。致傷部位選擇肌肉豐滿處，臀部致傷位置為髂前上棘后側4 cm，肩胛部致傷位置距背中線10 cm。每只動物致傷4個部位(雙側臀部和雙側肩胛部)，每次致傷1個部位。

1.2.2 動物清創(chuàng)治療及分組

3只家豬隨機分為一側NPWT組，對側為紗布敷料組，每組6個創(chuàng)面；另選取兩只家豬形成的6個創(chuàng)面設為暴露組。致傷后6 h，暴露組送回動物房固定飼養(yǎng)，NPWT組及紗布敷料組行創(chuàng)面清創(chuàng)。去除表面壞死組織，搔刮至組織新鮮出血。雙氧水、洗必泰、生理鹽水沖洗創(chuàng)面，消毒創(chuàng)面周圍正常皮膚。按實驗分組進行創(chuàng)面包扎。紗布組:外層凡士林紗布、內層無菌干紗布覆蓋，并將紗布固定于周圍皮膚。NPWT組:制備、安放NPWT敷料，調節(jié)負壓至-125 mmHg，檢查貼膜的氣密性。

1.2.3 大體觀察

觀察創(chuàng)面色澤、腫脹情況、分泌物的顏色及數量，并拍照留檔。

1.2.4 組織學觀察

傷后6 h和治療后第3、5、7天，自創(chuàng)面中心取10 mm×10 mm×10 mm大小組織塊,福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚度制片，常規(guī)HE染色，顯微鏡觀察組織損傷、炎癥浸潤及肉芽生長情況。

1.2.5 創(chuàng)面組織細菌計數

傷后6 h和治療后第3、5、7天取材。取材前生理鹽水紗布擦拭創(chuàng)面，除去滲液及壞死組織，以無菌方法取創(chuàng)面中央組織，大小約2 mm×2 mm×2 mm，稱重后玻璃勻漿器制成1.0 mL的勻漿液，按l:l0進行不同比例稀釋，于各梯度取0.5 mL標本稀釋液接種于瓊脂平板上，37℃孵育24 h，計數平板上的細菌菌落。每克組織內的細菌數=菌落數×稀釋倍數/標本重量，單位cfu/g(cfu:colony-forming unit，菌落形成單位)。

1.2.6 動物飼養(yǎng)

清創(chuàng)后動物自制五孔板固定籠內飼養(yǎng)。每日肌注青霉素40 000 U/Kg。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 創(chuàng)面大體觀察

傷后第3天:NPWT組局部可見新生肉芽組織，創(chuàng)面濕潤，分泌物少(圖1A)。紗布組組織水腫，創(chuàng)面基底凹凸不平，創(chuàng)面可見壞死肌肉組織，表面少量膿性分泌物(圖1B)。暴露組創(chuàng)周紅腫明顯，創(chuàng)面內滲液，異味明顯；創(chuàng)緣可見1～2 cm皮緣發(fā)黑，呈燒灼樣損傷；創(chuàng)面基底局部肌肉外露，質軟色暗紅，夾之不收縮，切割不出血(圖1C)。

傷后第5天:NPWT組創(chuàng)面肉芽新鮮，色紅，稍水腫，觸之易出血(圖2A)。紗布組創(chuàng)面深度較前稍加深，局部肌肉組織壞死，少部分肉芽生長，蒼白水腫(圖2B)。暴露組創(chuàng)面較前擴大，痂皮未見溶解；創(chuàng)面滲液多，異味明顯，創(chuàng)周紅腫(圖2C)。

傷后第7天:NPWT組滲液少，創(chuàng)面內肉芽致密，組織無明顯水腫(圖3A)。紗布組肉芽面積較前稍增大，滲液較第5天減少(圖3B)。暴露組局部痂皮溶解，下方可見少量肉芽組織，水腫質脆，表面有膿性分泌物，量多伴惡臭，創(chuàng)緣紅腫(圖3C)。

2.2 創(chuàng)面組織細菌計數

傷后第3天:NPWT組可見炎性細胞浸潤，成纖維細胞增生，細胞水腫減退(圖4A)。紗布組可見炎性細胞浸潤較明顯，肌細胞間有少量成纖維細胞增生(圖4B)。暴露組可見大量炎性細胞浸潤，部分肌纖維出現溶解壞死(圖4C)。

傷后第5天:NPWT組新生肉芽鮮紅，成纖維細胞增多，可見新生的微毛細血管(圖5A)。紗布組炎性浸潤明顯，肌細胞周圍較多成纖維細胞，未見微毛細血管形成，無明顯肉芽生長(圖5B)。暴露組組織水腫明顯，肌細胞碎裂溶解，伴有大量炎性細胞浸潤(圖5C)。

傷后第7天:NPWT組肉芽組織致密，炎性細胞少，可見成形血管(圖6A)。紗布組肉芽組織疏松，可見微毛細血管形成(圖6B)。暴露組大片肌細胞溶解壞死，呈空泡狀，細胞結構消失，炎癥明顯(圖6C)。

2.3 創(chuàng)面組織細菌計數

治療前各組間細菌數無明顯差異。治療后各時間段NPWT組細菌計數均較紗布組、暴露組數值小，統(tǒng)計學差異顯著(表1)。NPWT治療后第3天后計數為(3.282±0.336)×105cfu/g，以后隨時間延長計數不再增加；第5天細菌計數降至感染臨界水平以下。紗布組第5天細菌計數達到峰值，后緩慢下降。暴露組細菌計數逐漸增高，第7天達到109cfu/g水平，感染嚴重(圖7)。

圖1 治療后第3天創(chuàng)面大體觀Fig.1The gross observation 3 days after treatment

圖2 治療后第5天創(chuàng)面大體觀Fig.2The gross observation 5 days after treatment

圖3 治療后第7天創(chuàng)面大體觀Fig.3The gross observation 7 days after treatment

圖4 治療后第3天創(chuàng)面組織HE染色(400×)Fig.4HE staining observation 3 days after treatment(400×)

圖5 治療后第5天創(chuàng)面組織HE染色(200×)Fig.5HE staining observation 5 days after treatment(200×)

圖6 治療后第7天創(chuàng)面組織HE染色(200×)Fig.6HE staining observation 7 days after treatment(200×)

圖7 創(chuàng)面組織細菌計數Fig.7Wound organization bacterial count

表1 不同時間點各組細菌計數(±s，×105cfu/g)Table 1Bacterial counts of specimens from each group at different time points(±s，×105cfu/g)

表1 不同時間點各組細菌計數(±s，×105cfu/g)Table 1Bacterial counts of specimens from each group at different time points(±s，×105cfu/g)

NPWT group(n=6)Gauze group(n=6)Exposure group(n=6)6 hours0.095±0.0150.101±0.0170.102±0.015 3 days after treatment3.282±0.33652.320±5.362268.263±28.416 5 days after treatment0.539±0.07593.457±7.4041 479.266±142.044 7 days after treatment0.096±0.02146.621±4.49110 197.759±941.823

3 討論

上世紀50年代開始，細菌計數被認為能直觀并準確地反映創(chuàng)面感染程度，并進而預測組織愈合情況。細菌計數達到105cfu/g被視為是感染的臨界值[3]。爆炸傷組織損傷嚴重，創(chuàng)面缺乏正常皮膚的屏障作用，水、蛋白質丟失，創(chuàng)面細菌感染率較高。控制感染有3個主要手段:清創(chuàng)、創(chuàng)面沖洗、特異性抗生素應用。自NPWT發(fā)明以來，大量研究發(fā)現，NPWT治療可以降低細菌負荷[4-5]。也有部分研究觀察到治療過程中細菌計數升高，但創(chuàng)面臨床情況改善[6]。針對這種傷口愈合而細菌負荷并未降低的現象，Moues等[7]推測，相對于細菌的數目而言，細菌的種類、性質、毒力以及機體對抗感染的能力更為重要。美軍已經逐漸將NPWT運用到戰(zhàn)傷救治中，將創(chuàng)面與周圍戰(zhàn)場、病室環(huán)境相隔離，有效保持創(chuàng)面清潔并減少創(chuàng)面感染。Leininger等[8]運用NPWT治療88例高能爆炸所致軟組織創(chuàng)面，無創(chuàng)面感染及并發(fā)癥發(fā)生。Geiger等[9]對合并廣泛軟組織和骨質缺損(Ⅲ/Ⅳ級開放性骨折)的68名伊戰(zhàn)傷員，運用NPWT進行創(chuàng)面準備，減少了急、慢性骨髓炎的發(fā)生。

本實驗顯示，NPWT早期治療爆炸傷創(chuàng)面，能抑制細菌增殖，降低組織細菌負荷。各時間段NPWT組細菌計數均較紗布組、暴露組數值小。NPWT組治療后第3天后計數為(3.282±0.336)×105cfu/g，后隨時間延長，計數不再增加；第5天細菌計數降至感染臨界值水平以下。NPWT早期治療，能有效控制爆炸傷創(chuàng)面細菌增殖的作用機制，其可能機制是:①貼膜的屏障作用，NPWT使創(chuàng)面與周圍環(huán)境相隔離，有效保持創(chuàng)面清潔并減少創(chuàng)面感染。與平原地區(qū)相比，高原環(huán)境下細菌增殖速度減緩，細菌計數達到107cfu/g時才出現感染，可能與低氧環(huán)境有關[10]。②負壓的虹吸作用將細菌、滲液及壞死物質從創(chuàng)面清除，組織細菌量減少，減少條件性致病菌增殖[11]。負壓產生的吸引力量減少了細菌向深面組織的侵襲，抑制了感染擴散。③減少第三間隙內液體，減輕創(chuàng)面水腫。軟組織爆炸傷損傷嚴重，壞死物質及滲出多，組織水腫明顯，循環(huán)阻塞引起細胞持續(xù)性壞死及組織繼發(fā)性感染。NPWT治療有效減輕組織水腫，縮短毛細血管與修復細胞之間的距離，增加氧和營養(yǎng)的轉運，白細胞更容易外滲到達微生物定殖區(qū)域，提高了組織的抗感染能力[12]。④NPWT治療后，組織細菌負荷減輕，避免了過度炎癥反應。適度的炎癥促使創(chuàng)面自炎癥期轉入為增殖期變化，肉芽組織形成，創(chuàng)周上皮組織向創(chuàng)面內遷移，增強了創(chuàng)面的屏障作用。

伊拉克戰(zhàn)爭中，美軍已廣泛應用NPWT早期治療皮膚軟組織戰(zhàn)創(chuàng)傷，文獻報道應用后可以減輕醫(yī)護人員工作量，提高治療效果。Morykwas等[5]證實，與濕紗布敷料相比，應用NPWT治療家豬創(chuàng)面肉芽形成的體積可以增加約60%；進一步的研究表明，負壓在125 mmHg時肉芽生長效果較25 mmHg或500 mmHg要好[13]。本研究通過觀察爆炸傷創(chuàng)面肉芽生長的情況，發(fā)現NPWT組肉芽形成較其他兩組更早。治療后第3天，NPWT鏡下即表現出成纖維細胞增生，水腫明顯減輕；第5天時NPWT組新生肉芽鮮紅，并可以見多個微毛細血管形成，而紗布組僅有少量肉芽生長；第7天時NPWT組肉芽組織致密，成形血管形成。NPWT早期治療促進肉芽生長的作用，可能與以下因素有關:①負壓作用減輕組織水腫，改善創(chuàng)面的供血、供氧，負壓治療后組織氧含量上升，增強細胞分化能力，并且提高成纖維細胞的增殖和遷移，調控膠原生成。②負壓吸引的機械性牽張作用。細胞受到表面張力才能響應細胞因子變化發(fā)生分裂和增殖；未受牽拉時，細胞外形呈球狀，細胞周期停止，并出現凋亡趨勢[14]。NPWT導致創(chuàng)面微變形，這種變化使細胞骨架中細胞整合素發(fā)生斷裂，觸發(fā)了細胞內第二信使的釋放(如前列腺素，磷酸肌醇，蛋白激酶C，細胞內鈣)，引起細胞生長、增殖和分化[15]。負壓張力作用下，細胞伸展5%～20%時可以促進細胞增殖[15]，毛細血管芽定向生長。③負壓吸引促進創(chuàng)面內修復性生長因子分泌，降低創(chuàng)面內抑制性因子水平。NPWT能夠提高創(chuàng)面組織內VEGF、FGF-2以及PDGF的表達[16]。VEGF、FGF-2已被證實是最強的血管新生刺激因子，VEGF主要促進毛細血管形成，FGF-2則傾向于促進小動脈形成。兩者在血管新生的不同階段起作用，共同作用可以更好地促進血管新生。FGF-2、PDGF均具有趨化及增殖作用，促進創(chuàng)面修復。同時，負壓作用可將抑制成纖維細胞及內皮細胞的增殖的多種細胞因子、金屬蛋白酶以及膠原酶，從創(chuàng)面中引流清除，從而使修復性生長因子更好地發(fā)揮作用。④控制感染，促進組織由炎癥期向增殖期轉變。感染可延長炎癥反應期，妨礙肉芽組織形成。

NPWT早期應用治療豬爆炸傷軟組織缺損，能有效抑制創(chuàng)面細菌增殖，減輕細菌負荷，避免創(chuàng)面過度炎癥反應；并可早期啟動爆炸傷軟組織創(chuàng)面細胞增殖過程，促進肉芽組織生長。因此，在爆炸傷傷軟組織缺損創(chuàng)面的早期治療中具有積極的意義。

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