HPLC測(cè)定長(zhǎng)喙烏頭中草烏甲素的含量*

龔云麒，張 偉，朱 澤

(昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，云南昆明 650021)

長(zhǎng)喙烏頭為毛茛科植物長(zhǎng)喙烏頭Aconitum georgei Comber.的干燥塊根，長(zhǎng)喙烏頭產(chǎn)自云南西北部 (中甸、麗江)，因根部芽嘴似禽類喙且較長(zhǎng)而以“長(zhǎng)喙烏頭”為藥材正名［1－2］。研究表明，長(zhǎng)喙烏頭中含有草烏甲素，而藥理研究顯示草烏甲素具有顯著的鎮(zhèn)痛作用和抗炎作用，不良反應(yīng)低，臨床上主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (OA)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)、肩周炎、腰肌勞損、四肢扭傷、挫傷等癥［3－5］。由于療效確切，草烏甲素原料及其制劑被2005版、2010版《中國(guó)藥典》二部收載［6－7］。隨著草烏甲素制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，作為草烏甲素提取用原料藥材需求也不斷增長(zhǎng)，因此尋找新的植物資源，以滿足草烏甲素提取已成為必須。而毛茛科是含有毒植物種類最多的科之一，并且長(zhǎng)喙烏頭作為草烏甲素的原料藥材沒(méi)有規(guī)范的質(zhì)量控制方法，因此我們建立了長(zhǎng)喙烏頭中草烏甲素含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便、快速，為該藥用植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材

長(zhǎng)喙烏頭藥材分別采集于麗江永勝、華坪、玉龍、寧蒗等地區(qū)和市售樣品 (批號(hào) 20070928、20080114)，共10個(gè)批次，經(jīng)昆明植物研究所李錫文教授鑒定為毛茛科植物長(zhǎng)喙烏頭Aconitum georgei Comber。

1.2 儀器及試劑

安捷倫1100液相色譜儀，SK06G型超聲波清洗器 (上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，BP221S型分析天平 (北京賽多利斯儀器公司)。

乙腈、磷酸為色譜純 (美國(guó)Fisher公司);其余均為分析純，水為注射用水，草烏甲素對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，編號(hào)100530－200501。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Phenomenex C18(4.6×250mm);0.2%三乙胺水溶液 (用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.1±0.1)－乙腈 (65∶35)為流動(dòng)相;流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)260nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量:10μl，理論塔板數(shù)按草烏甲素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取草烏甲素對(duì)照品適量，加少量0.1mol/L鹽酸溶解后，加水稀釋制成每1mL含40μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粗粉約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱定重量，超聲處理 (功率250W，頻率35kHz)30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取草烏甲素對(duì)照品20.8mg，加0.1mol/L鹽酸溶解后，加水稀釋定容至100mL容量瓶中，制成儲(chǔ)備液 (0.208mg/mL)，分別精密量取儲(chǔ)備液 2.5，3.5，4.0，5.0，5.5，6.5，7.5mL 分別置25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配制成20.8， 29.12， 33.28， 41.6， 45.76， 54.08，62.4μg/mL的溶液，注入高效液相色譜儀測(cè)定峰面積，以草烏甲素的濃度 (μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程:Y=17.244X－8.820，r=0.9998(n=7)。結(jié)果表明在20.8μg/mL～62.4μg/mL范圍內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定，峰面積和濃度呈良好線性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 長(zhǎng)喙含烏頭含量測(cè)定線性關(guān)系

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取同一份供試品溶液于制備后0，2，4，8，12，24h測(cè)定，RSD=0.20%.表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

以同一份對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣7次，草烏甲素峰平均保留時(shí)間 12.64min，保留時(shí)間 RSD=0.36%;平均峰面積 697.66，峰面積 RSD=0.16%.表明儀器重復(fù)性好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一份長(zhǎng)喙烏頭藥材粗粉，同時(shí)稱取6份，照供試液制備的方法平行提取處理，測(cè)定草烏甲素的含量，RSD=1.43%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的長(zhǎng)喙烏頭藥材各0.25g，共9份。分別加入適量對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下的方法制備和測(cè)定草烏甲素含量，計(jì)算回收率，數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明本法回收率良好。

表2 長(zhǎng)喙烏頭藥材中草烏甲素測(cè)定加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取不同長(zhǎng)喙烏頭藥材粉末各0.5g，按2.3項(xiàng)下的方法制備和測(cè)定草烏甲素含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 長(zhǎng)喙烏頭藥材含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

采用HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地及市售長(zhǎng)喙烏頭中草烏甲素的含量，結(jié)果顯示，HPLC法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可用于長(zhǎng)喙烏頭中有效成分含量測(cè)定和質(zhì)量控制，也為該藥用植物資源的利用提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，2004:207.

［2］中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，2000:69－70.

［3］唐希燦.鎮(zhèn)痛抗炎新藥滇西嘟拉堿甲 ［J］.新藥與臨床，1986，5(2):120－121.

［4］陳筱云，夏曉玲，熊濟(jì)民，等.草烏甲素片鎮(zhèn)痛抗炎作用134例臨床觀察［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，1996，17(3):54－55.

［5］張?jiān)闯?，楊清銳，尹宏恩，等.草烏甲素治療骨關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床觀察 ［J］.中藥藥理與臨床，2000，16(2):43－45.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 (二部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:373－374.

［7］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 (二部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:510－511.

［8］肖培根，王鋒鵬，高峰，等.中國(guó)烏頭屬植物藥用親緣學(xué)研究 ［J］.植物分類學(xué)報(bào)，2006，44(1):1－46.