石決明清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基活性的研究

王志力 ，梁紅寶 ，伍久林 ，陳 立 ，張其清 ,2*

1.福州大學生物和醫藥技術研究院，福建福州 350002；2.中國醫學科學院生物醫學工程研究所，天津 300192

石決明為海產鮑科軟體動物鮑魚（abalone）的貝殼，是一種名貴的動物類中藥，具有平肝潛陽、清肝明目的功效。在水產養殖業，鮑魚是一種重要的經濟軟體動物[1]，主要分布在東亞地區[2]，中國作為最大的鮑魚生產國，每年要產生大量的鮑魚殼，以致形成石決明藥材產量過剩的局面。因此，有必要開展鮑魚殼高附加值生物活性提取物方面的研究，填補該類中藥開發研究領域的空白。

石決明同其他貝殼類物質一樣，含有大量的碳酸鈣、多種微量元素[4-5]和蛋白質成分等有機物。目前，對石決明的研究多集中在其成分、結構及兩者的相關性方面，而對具有生物活性的藥效成分的研究卻鮮有報道?？寡趸饔檬欠乐味喾N疾病的重要藥效機制之一。本文采用生化分離方法對石決明成分進行分離，并通過對各成分體外清除DPPH自由基活性的研究，發現石決明含有多種抗氧化活性成分，為闡釋石決明藥理學作用機制提供了依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器和設備

TP-114電子天平（美國Sartorius Denver公司），D8C真空泵（德國Ernst Leybold公司），旋轉常溫濃縮儀（日本EYELA公司），Primo R臺式冷凍離心機（美國Thermo Scientific公司），蛋白電泳儀（美國GE公司），離子交換層析系統（日本島津公司），Aquapro超純水機（重慶頤洋企業發展有限公司），UV-1600紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.2 材料和試劑

閩產雜色鮑 （haliotis diversicolor reeve）（來自福建誼來鮑魚制品有限公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical-2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]（由 Alfa Aesar公司提供），羧甲基葡聚糖凝膠C-25（CM-Sephadex C-25）（美國General Electric公司生產），蛋白Marker（美國Fermentas公司生產），其余試劑均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品處理

將雜色鮑貝殼剝離后用去離子水清洗干凈，常溫鼓風干燥至恒重，用粉碎機把鮑魚殼粉碎成200目以上的粉末，稱取200 g，加入5%稀酸溶液500 ml，4℃攪拌至沒有氣泡產生，用稀堿溶液調節pH值至7.0，過濾，取濾液，低溫高速離心15 min，取上清液，低壓濃縮蒸發至50 ml，低溫透析24 h，透析液4℃冰箱保存備用。

2.2 離子交換色譜分析

用CM-Sephadex C-25離子交換色譜系統分離“2.1”項下制備的石決明提取液，洗脫條件為：0～1.0 mol/L溶解在20 mmol/L PBS（pH 8.0）緩沖液中的NaCl溶液線性梯度洗脫IEC上樣層析柱，流速為1.0 ml/min，紫外吸收波長為280 nm光密度（OD280nm）檢測，自動收集器每管3 ml收集洗脫液，24 h低溫透析，4℃保存備用。共制備60管。

2.3 蛋白成分檢測

[6]的方法，SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析“2.2”項下序號為 18、20、25、34、38、45 收集管的蛋白組分（依據“2.2”項下各管OD280nm值，OD280nm值較大者入選），空白對照用去離子水代替IEC分離樣品，濃度為12%聚丙烯酰胺凝膠作為分離膠，考馬斯亮藍R-250溶液染色。

2.4 DPPH·清除活性分析

參考文獻[7]的方法，對“2.2”項下各管收集物的DPPH自由基清除能力進行檢測，反應體系包括：0.5 mg/ml樣品溶液 0.2 ml，2.0×10-4mol/L DPPH 溶液 2.0 ml，加超純水至反應總體積為4 ml。37℃水浴條件下避光反應30 min，空白實驗以等體積無水乙醇代替DPPH溶液，對照以等體積去離子水代替樣品溶液，檢測波長為517 nm。DPPH·清除率計算依據公式：

其中：Ax為加入樣品的吸光度；Axo為樣品的吸光度；Ao為未加樣品的吸光度。

2.5 石決明樣品處理及IEC色譜分析

石決明溶解于稀酸溶液，可觀察到溶液變為黃褐色，除去不溶性物質后，經過離子交換層析，在280 nm處測定各管收集液光密度值，得到雙峰洗脫曲線，第一個峰（對應第25管）洗脫時間長，峰型為不對稱寬峰，推測該峰包含多種成分。第二個峰（對應第38管）洗脫時間短，峰型為尖峰，第38管分離液OD280nm為1.875，位于峰尖位置，可能是一種組成比較簡單的組分。見圖1。

圖1 CM-Sephadex C-25離子交換層析梯度洗脫石決明提取物色譜

2.6 蛋白成分分析

SDS-PAGE電泳結果表明，與色譜峰相對應的第25和第38管溶液均顯示出明顯蛋白條帶，而其余收集組分對應的條帶明顯減弱，第45管與對照組都沒有顯示出明顯條帶，所有蛋白條帶均集中在18.4～25.0 kDa分子量標準Marker蛋白條帶之間，說明經過IEC分離得到主要蛋白組分的分子量在18.4～25.0 kDa 之間，與 Michenfelder[8]從紅鮑（haliotis rufescens）貝殼中獲得的礦化連接蛋白AP24分子量相近。見圖2。

圖2 石決明分段分離組分SDS-PAGE電泳

2.7 DPPH自由基清除能力測定

清除DPPH自由基活性測試結果表明，石決明溶液經過IEC色譜分離后的第18、38、55管以后各分離樣品均具有較高DPPH自由基清除能力，第60管以后樣品的DPPH自由基清除率能達到45%以上。第38管樣品在280 nm處有最大吸收，而且蛋白電泳條帶明顯，說明石決明可能含有具有抗氧化活性的蛋白組分。見圖3。

圖3 石決明提取物對DPPH自由基清除率

3 討論

石決明是臨床常用的中藥之一，由角質層、棱柱層和珍珠層組成，其有機組分主要存在于珍珠層。貝殼珍珠層與珍珠成分非常相似，而后者水提液能顯著提高小鼠體內過氧化物歧化酶活性，降低過氧化產物水平[9-10]。有文獻報道，珍珠層成分具有很高的活性氧自由基清除活性[11]，與本研究結論相近，推測貝殼珍珠層與珍珠具有相似的活性氧自由基清除活性成分，可以作為昂貴藥用珍珠的理想替代品，具有廣闊的應用前景。

本研究根據石決明酸溶性水提液組分在不同離子濃度條件下對羧甲基葡聚糖凝膠吸附力的不同，通過離子交換色譜，獲得了含有不同蛋白成分的分離液，經過SDS-PAGE電泳分析發現，各收集管分離物的主要蛋白分子量均在18.4～25.0 kDa之間，而且含量與280 nm處光密度測量值呈正相關。IEC色譜分離液DPPH自由基清除能力結果表明，除部分組分的清除能力與蛋白含量顯著相關外，其余樣品與蛋白含量的多少不存在相關性。具有DPPH自由基高清除活性的第18、50管及以后各管組分，在280 nm處沒有強吸收，也沒有明顯的蛋白電泳條帶，說明石決明除含有抗氧化蛋白成分外，還存在可以清除DPPH自由基的其他高活性物質。因此，抗氧化藥效成分可能是石決明藥理學作用的物質基礎，石決明抗氧化作用研究為進一步揭示貝殼類中藥的藥用機制提供了科學依據。

[參考文獻]

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