孕酮對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷神經(jīng)元凋亡的影響

雷曉溪 ，鄢秀菊 ，劉 蘇 ，吳 君 ，王 莉

1.廣東省東莞市南城人民醫(yī)院眼科，廣東東莞 523071；2.重慶市第一人民醫(yī)院視明眼科中心，重慶 400040；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科中心，重慶 400010

視神經(jīng)損傷是眼科常見病理過程，主要病理改變是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及內(nèi)核層細(xì)胞凋亡。青光眼、血管栓塞、出血等可造成神經(jīng)元缺血，改善缺血后，視力反而下降。因此，探索缺血再灌注后視力下降的機(jī)制和治療方法，具有重要意義。孕酮在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后有一定的神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生作用，是有潛在治療作用的神經(jīng)甾體，但孕酮對視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡的影響少見報(bào)道。本研究應(yīng)用視網(wǎng)膜缺血再灌注模型，觀察孕酮對視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選擇新西蘭大白兔36只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體重2.0～2.5 kg；隨機(jī)分為正常組4只，孕酮組和對照組，各16只，孕酮組和對照組再依不同再灌注時(shí)間，各按造模后 12、24、48、72 h 分為四組，各組 4 只。

1.2 試劑與儀器

試劑：孕酮注射液、速眠新（長春軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所提供），鏈霉卵白素—過氧化物酶（HistostainTM－SP）免疫組化試劑盒、TUNEL試劑盒（ROCHE公司提供），兔多抗Bcl-2 IgG（武漢Boster公司提供）。儀器：GD-8型多媒體彩色圖像病理分析儀。

1.3 模型建立

采用常規(guī)飼養(yǎng)新西蘭大白兔。對照組和孕酮組分別在缺血前24 h肌內(nèi)注射4 ml/kg生理鹽水和4 mg/kg孕酮，1%地卡因滴眼局部麻醉，并給予速眠新0.3 ml/kg耳緣靜脈注射。麻醉成功后將大白兔置于兔架固定器上固定，將連接生理鹽水瓶輸液管的4號半針自大白兔角膜緣穿入前房固定，升高輸液瓶至與眼球垂直距離150 cm處（14.63 kPa眼內(nèi)壓），使網(wǎng)膜血管斷流，可見球結(jié)膜蒼白外觀，維持1 h，遂將輸液瓶高度漸放低，至兔眼球水平，恢復(fù)視網(wǎng)膜血供。

1.4 標(biāo)本制作

給予0.3 ml/kg速眠新耳緣靜脈注射麻醉動物，摘除眼球并編號。眼球于4%多聚甲醛固定6 h，只保留眼球視網(wǎng)膜，放入10%和20%蔗糖溶液內(nèi)各2 h，30%蔗糖溶液內(nèi)過夜；OCT包埋劑填充眼球，沿矢狀面作連續(xù)5 μm切片；HE染色并于光鏡下觀察對照組和孕酮組視網(wǎng)膜細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)變化，測量從內(nèi)界膜到內(nèi)核層間的長度。

1.5 免疫組化法檢測Bcl-2蛋白表達(dá)

采用0.3%H2O2室溫處理切片10 min，蒸餾水洗3次，浸入pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中，加熱達(dá)98℃斷電，95～98℃處理30 min，冷卻后滴加山羊血清封閉液，處理20 min，加Bcl-2多克隆抗體，4℃過夜，PBS洗3次，加入生物素化羊抗兔 IgG，37℃處理 90 min，PBS洗 3次，加試劑 S-A/RP，37℃處理30 min，PBS洗5次，DAB顯色10 min后脫水、透明、封片。

1.6 凋亡檢測

采用新制備的4%多聚甲醛溶液室溫下固定切片30 min，PBS洗片，放入0.3%H2O2溶液中恒溫處理10 min，PBS洗3次；將其置于新配制的4℃0.1%Triton X-100及0.1%枸櫞酸鈉緩沖液中各處理5 min，PBS洗3次；加TUNEL混合反應(yīng)液，37℃處理 60 min，PBS洗 3次；滴加 Converter-POD，37℃處理30 min，PBS洗 6次，每次洗 5 min；DAB顯色 15 min，中性樹膠封片。陽性對照組于反應(yīng)體系前用DNA酶Ⅰ消化，陰性對照組不加末端核糖核酸轉(zhuǎn)移酶。

1.7 觀察指標(biāo)

于光鏡10×40視野下進(jìn)行結(jié)果觀察，每只眼球取4張片觀察，每張切片取4個(gè)視野。HE染色：測量從內(nèi)核層到內(nèi)界膜間的長度，并計(jì)數(shù)內(nèi)核層每100 μm長視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)；計(jì)量每100 μm長視野內(nèi)表達(dá)Bcl-2和凋亡陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜組織學(xué)情況

光鏡下觀察，孕酮組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度厚于對照組，兩組比較各時(shí)間段差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。孕酮組視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)多于對照組，且細(xì)胞排列較規(guī)整，兩組比較各時(shí)間段差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 孕酮組與對照組不同再灌注時(shí)間視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度及內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)比較（）

表1 孕酮組與對照組不同再灌注時(shí)間視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度及內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05

組別 時(shí)間（h）1224487212244872眼數(shù)孕酮組對照組88888888視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度（μm）78.15±2.20*73.31±3.18*67.10±5.14*61.14±4.12*69.13±3.0862.92±2.4555.24±4.1349.75±5.45內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)（/100 μm）47.76±2.77*42.23±2.33*33.40±1.35*27.35±1.87*41.14±1.5638.00±2.9030.18±1.6523.27±3.26

2.2 Bcl-2蛋白表達(dá)情況

正常組視網(wǎng)膜Bcl-2染色陰性。孕酮組缺血再灌注24 h后可見 Bcl-2 陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)為（11.47±1.53）/100 μm；對照組缺血再灌注24 h在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層可見陽性著染，陽性細(xì)胞數(shù)為（7.06±1.15）/100 μm，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。

2.3 細(xì)胞凋亡情況

正常組視網(wǎng)膜TUNEL染色陰性，無凋亡。對照組缺血再灌注12 h，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層可見凋亡細(xì)胞，缺血再灌注24 h凋亡達(dá)到峰值，且凋亡細(xì)胞主要見于視網(wǎng)膜內(nèi)核層，而視網(wǎng)膜外核層凋亡細(xì)胞表達(dá)不明顯，24 h后凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，缺血再灌注48 h時(shí)凋亡征象已明顯減弱。計(jì)數(shù)凋亡高峰期（缺血再灌注24 h）孕酮組和對照組視網(wǎng)膜內(nèi)核層陽性細(xì)胞數(shù)分別為（4.03±0.55）/100 μm 和（9.45±1.63）/100 μm，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

視網(wǎng)膜急性缺血性疾病臨床常見，如閉角型青光眼急性發(fā)作期、視網(wǎng)膜中央動脈阻塞等，目前主要治療措施是恢復(fù)視網(wǎng)膜血液循環(huán)。但視網(wǎng)膜血液再通后會出現(xiàn)視力下降甚至出現(xiàn)不可逆的視力損害，其損傷的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，是目前國內(nèi)外研究的難點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)所采用的提高眼壓方法制作視網(wǎng)膜缺血模型，已被許多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)可行[1-2]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，用TUNEL法原位標(biāo)記凋亡細(xì)胞主要位于視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層，直觀地證明了缺血再灌注損傷的視網(wǎng)膜存在神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象。Niu等[3]研究證明，凋亡是視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡的重要方式，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜不同類型的細(xì)胞死亡中，凋亡是主要形式之一。有研究認(rèn)為，神經(jīng)缺血再灌損傷由微血管的損傷和炎癥、鈣超載、一氧化氮合酶、NF-κB及其誘導(dǎo)的因子及氧自由基等多種因素引起。Wang等[4]研究證實(shí)，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中凋亡是神經(jīng)元丟失的重要因素之一，細(xì)胞凋亡受多種相關(guān)基因調(diào)控如Bax、Caspase、Bcl-xl、Bcl-2等。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕酮組神經(jīng)元凋亡數(shù)目均少于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明孕酮可減輕神經(jīng)損傷，減少缺血-再灌注后細(xì)胞凋亡，該結(jié)果與既往研究相符[5-6]。多種因素在缺血、缺氧時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存與死亡。目前認(rèn)為，在細(xì)胞凋亡過程中會出現(xiàn)P53、Bax、Bad等基因的表達(dá)，激活蛋白水解酶，使DNA的修復(fù)酶如PARP和DNA-PKcs等降解，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。抑制細(xì)胞凋亡過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括抑制凋亡基因如Bcl-2、Bcl-xl等基因被激活表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。探討凋亡與相關(guān)基因的關(guān)系將為尋找視網(wǎng)膜急性缺血性疾病的治療方法提供新線索。

Bcl-2是從小鼠B細(xì)胞淋巴瘤中分離得出的原癌基因，編碼26 ku的胞漿蛋白，在成熟或走向凋亡的細(xì)胞中不表達(dá)，而在各種正常細(xì)胞的激發(fā)和發(fā)育中表達(dá)[5]。已發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族成員包括 Bcl-2、Bcl-x、tmcl-1、Bak、Bax、Bag-1 等[7]。 Bcl-2蛋白位于核膜、線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，不存在于其他膜性結(jié)構(gòu)上[8]。Bcl-2的功能是通過阻止細(xì)胞凋亡早期環(huán)節(jié)而阻止凋亡的發(fā)生，可加速DNA修復(fù)，通過阻止受損的DNA轉(zhuǎn)錄出對細(xì)胞凋亡基因有激活作用的相關(guān)信號或相關(guān)產(chǎn)物起作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，孕酮組Bcl-2蛋白表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示孕酮可上調(diào)視神經(jīng)損傷中Bcl-2基因的表達(dá)，加速DNA損傷的修復(fù)，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

孕酮可減輕神經(jīng)缺血-再灌注后的神經(jīng)元凋亡，而上調(diào)Bcl-2表達(dá)可能是其發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的分子機(jī)制之一，作為一種自身合成的神經(jīng)甾體激素，孕酮具有不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，是一種潛在的有應(yīng)用前景的神經(jīng)保護(hù)藥物。

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