肝細胞癌中HBx蛋白與生存素蛋白表達的關系及其意義

陳 江，崔 彬，姜漢國

廣東省廉江市人民醫院腫瘤科，廣東廉江 524400

乙型肝炎病毒感染影響到全球近4億人口，是肝細胞癌（hepatic cellular cancer，HCC）最重要的獨立危險因素。乙型肝炎病毒是3.4 kb的DNA病毒，含有4個部分雙鏈的開放讀碼框，編碼C、S和X蛋白及病毒DNA聚合酶，其中X蛋白（HBx）已明確和腫瘤發生有關。X蛋白是一種多功能蛋白，通過一種未知的機制使細胞分裂及死亡發生調節障礙，HBx缺乏轉變活性，但可以使肝臟表達HBx的易感品系的轉基因小鼠發生肝細胞癌[1-2]。生存素是一種新近發現的在人類大部分腫瘤組織中表達的一種抗凋亡蛋白，其主要作用是凋亡抑制及細胞周期調節。本試驗通過免疫組織化學方法檢測二者在HCC組織的表達，探討其在HCC發生中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2000年2月～2010年5月我院外科手術切除的HCC標本58例，臨床和病理資料完整。患者均未經過任何抗腫瘤治療，其中，男46例，女12例；年齡23～86歲，中位年齡60歲；Edmondson病理分級：1～2級 16例，3級以上 42例。47例AFP增高，伴有門靜脈癌栓18例，腹腔淋巴結及遠處轉移9例。所有組織標本均經10%甲醛固定，石臘包埋，5 μm連續切片。

1.2 方法與試劑

HBx蛋白抗體和人生存素（FL-142）單抗及S-P試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組化采用S-P方法，操作步驟如下：石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育5～10 min；微波抗原修復；正常山羊血清封閉，室溫15 min，滴加p53和生存素抗原工作液，冰箱內4℃過夜；PBS沖洗，滴加第二代生物素，標記二抗工作液，室溫20 min；PBS沖洗，滴加第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫20 min；PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，封片。已知的肝癌HBx及生存素陽性切片為陽性對照，磷酸鹽緩沖液（PBS）作為空白對照。

1.3 結果判斷

觀察每張切片至少有5個具有代表性的高倍視野，不少于1000個細胞，HBx和生存素均以胞質或胞核出現棕黃色顆粒為陽性染色，這樣的細胞大于或等于100個為陽性，對免疫組化結果進行評估。HBx陽性表達定位于細胞核 （圖1），生存素陽性表達定位于細胞質（圖2），均呈棕黃色。

圖1 HBx陽性表達（S-P×200）

圖2 生存素陽性表達（S-P×200）

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計數資料用百分率表示，采用χ2檢驗，相關分析采用spearman等級相關系數，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白及生存素的表達及關系

HBx的陽性表達信號多為核型，生存素的陽性表達定位于細胞質，均呈黃色顆粒。HBx的陽性率為46.6%（27/58），生存素的陽性率為69.0%（40/58），差異有統計學意義（χ2=5.365，P＜0.05）；HBx陽性的 HCC組織生存素的陽性率為 70.4%（19/27），HBx陰性的HCC組織生存素的陽性率為 27.5%（11/40），差異有統計學意義（χ2=8.673，P＜0.05）。 等級相關分析表明，HCC組織中HBx和生存素的表達呈正相關（r=0.413，P＜0.05）。 見表 1。

2.2 乙型肝炎病毒X蛋白及生存素表達與肝細胞癌臨床病理參數的關系

HBx在HCC組織中的陽性表達率與Edmondson分級相關（r=0.4327，P＜0.05）；Ⅰ～Ⅱ級陽性率為 18.8%，≥Ⅲ級陽性率為57.1%。有門靜脈癌栓者的陽性率（66.7%）明顯高于無門靜脈癌栓者（37.5%），差異有統計學意義（P＜0.05）；AFP 增高者HBx的陽性率明顯高于正常者，差異有統計學意義（P＜0.05）；HBx 的表達與有無轉移無關（r=0.2354，P＞0.05）。生存素在病理分級差、有門脈癌栓及轉移和伴有AFP高的HCC組織中的陽性表達率明顯高于病理分級好、無門脈癌栓及轉移和不伴有AFP高的HCC組織的陽性表達率。見表1。

表1 肝細胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白及生存素的表達及關系[n（%）]

3 討論

嗜肝病毒科的來源于哺乳動物的正嗜肝DNA病毒具有表達X蛋白的功能，X蛋白的結構與宿主細胞DNA糖基化酶功能結構域具有同源相似特點，而DNA糖基化酶是DNA復制時堿基切除修復的主要酶[3]。在乙型肝炎病毒誘發的肝細胞癌的過程中X基因經常與肝細胞DNA整合，HBX促進細胞周期進程，使抑制細胞生長的調節因子失活，與p53及其他腫瘤抑制因子及衰老相關因子結合并抑制其功能。近年研究表明，HBX調節轉甲基酶轉錄，使DNA局部甲基化導致抑癌基因沉默或者使DNA全部甲基化造成染色體不穩定，從而在肝癌發生中起作用。抗凋亡作用與p53抑制有關，促進凋亡作用機制不明。HBX能夠增加端粒酶逆轉錄酶的表達及端粒酶的活性從而延長肝細胞壽命有利于惡變，羥基末端去除的HBX失去了抑制細胞增殖及促進凋亡性能，增強了其調控癌基因的功能，使胰島素樣生長因子調節異常，促進增殖及凋亡抑制，使細胞生長失控[4]。

生存素是人類基因組中的腫瘤特異性基因，正常的成人組織罕有表達，在大部分人類腫瘤中高表達。生存素含有特征性的鋅指結構稱為BIR結構域，屬于凋亡抑制蛋白（IPA）家族成員之一，其他凋亡抑制蛋白家族成員的凋亡抑制是直接與細胞內半胱天冬酶結合抑制其活性，生存素不能直接與半胱天冬酶結合，乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白（HBXIP）作為輔助因子在生存素引發的凋亡抑制起一定作用[5]。HBX蛋白的C末端與HBXIP結合再與生存素結合形成復合物，該復合物可以與前半胱天冬酶-9結合，從而阻止其募集到凋亡前酶活化因子（Apaf-1）上，使生存素借助細胞色素C介導的凋亡途徑選擇性地抑制半胱天冬酶的蛋白酶活性，在細胞凋亡中發揮橋梁作用[6]。

本研究顯示，HBX上調生存素的表達，提示肝細胞癌發生凋亡抑制。另外，HBx蛋白可與p53蛋白結合并使其失活，而生存素基因是一個被野生型p53基因抑制的基因[7]，HBx蛋白上調生存素在肝細胞癌中的表達形成凋亡抵抗，本研究結果證明了這一點。病理分級分化差，伴有門脈癌栓及AFP增高有轉移者HBx及生存素表達上調，表明HBx及生存素表達與肝細胞癌的惡性程度疾病進展有關。HBx上調生存素表達使細胞周期調控失常，凋亡障礙增殖過度，可能是乙型肝炎病毒感染引起肝細胞癌原因之一。

[1]Wen Y,Golubkov VS,Strongin AY,et al.Interaction of hepatitis B viral oncoprotein with cellular target HBXIP dysregulates centrosome dynamics and mitotic spindle formation[J].J Biol Chem,2008,283(5):2793-2803.

[2]陳江,吳曉燕.HBV感染對原發性肝細胞癌生物學行為及Survivin表達的影響[J].海南醫學院學報,2006,12(6):517-518.

[3]Van Hemert FJ,Van De Klundert MA,Lukashov VV,et al.Protein x of hepatitis B virus:origin and structure similarity with the central domain of DNA glycosylase[J].PLoS One,2011,6(8):233-242.

[4]Kew MC.Hepatitis B virus x protein in the pathogenesis of hepatitis B virus-induced hepatocellular carcinoma [J].J Gastroenterol Hepatol,2011,26(Suppl 1):144-152.

[5]Marusawa H,Matsuzawa S,Welsh K,et al.HBXIP functions as a cofactor of survivin in apoptosis suppression[J].EMBO J,2003,22(11):2729-2740.

[6]張曉東,馬宏濤,葉麗虹,等.HBXIP基因對乙肝病毒X蛋白誘導細胞凋亡的影響[J].中國生物化學與分子生物學報,2005,21(3):403-407.

[7]Wolann K,Pwocka K.Role of survivin in mitosis[J].Postepy Biochem,2007,53(1):10-18.