注射用法莫替丁細菌內毒素檢查法研究

陳 琪

廣東省藥品檢驗所藥理室，廣東廣州 510180

熱原檢查實質上就是內毒素的限量檢查。鱟試劑法對內毒素檢查具有專一、靈敏、快速簡便的特點，但目前藥典規定的品種尚有限，因此，擴大應用成了廣大藥檢人員普遍重視的問題[1]。本文根據《中國藥典》2010年版二部附錄XI E“細菌內毒素檢查法”[2]中所述的藥品細菌內毒素的檢查方法及其干擾試驗的基本原理，對注射用法莫替丁的細菌內毒素檢查可否限值提高進行了探索性研究，文中提供了分別來自同一廠家的3批供試品在兩個廠家鱟試劑下的干擾試驗數據，證實了本品種細菌內毒素檢查限值提高的可行性。同時，運用相同的方法檢查了不同廠家的17批供試品，檢查結果均合格。現將研究過程報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 實驗材料及藥品

細菌內毒素檢查用鱟試劑（購于廣東湛江安度斯生物有限公司，批號：1008202，靈敏度：0.125 EU/ml，規格：0.1 ml/支），細菌內毒素檢查用水（BET水，購于廣東湛江安度斯生物有限公司，批號：1003080，規格：5.0 ml/支）；細菌內毒素檢查用鱟試劑 （購于廣東湛江博康海洋生物有限公司，批號：1009030，靈敏度：0.125 EU/ml，規格：0.1 ml/支）。 細菌內毒素標準品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：150601-200968，效價：150 EU/支）。注射用法莫替丁（哈藥集團三精加濱藥業有限公司生產，批號：20100111、20100303、20100312）。

1.2 儀器

旋渦振蕩器（IKA-MS-1）；恒溫水浴箱（德國 Julabo 19A）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）的復核

上述兩個批號鱟試劑經由細菌內毒素標準品標定，結果均在 0.5λb～2.0λb（λb為標準靈敏度）之間，符合相關規定，可用于實驗。

2.2 樣品細菌內毒素限值（L）的確定

參考《中國藥典》2010年版二部附錄XI E“細菌內毒素檢查法”[2]，參考注射用法莫替丁的臨床實際應用情況，本品成人臨床日常用量為每天40 mg/60 kg，根據公式L＝K/M，其中K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑 K＝5 EU/（kg·h）；M 為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以 ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或 U/（kg·h）表示，人均體重按60 kg計算，注射時間不足1 h，按1 h計算。 將本品細菌內毒素限值確定為 L=5 EU/（kg·h）/（40 mg/60 kg）＝7.5 EU/mg。

2.3 最小有效稀釋濃度（C）的確定

限值L考慮為7.5 EU/mg時，根據公式C＝λ/L，當選用鱟試劑靈敏度為λ＝0.125 EU/ml時，供試品溶液中法莫替丁的最小有效稀釋濃度為C=λ/L＝0.017 mg/ml。

2.4 供試品干擾預實驗

選取靈敏度為0.125 EU/ml的細菌內毒素檢查鱟試劑，對1個廠家的供試品進行稀釋檢驗，稀釋濃度分別為0.060、0.030、0.020、0.008、0.004 mg/ml，具體過程如下：取本品 20 mg（1瓶）加細菌內毒素檢查用水溶解并稀釋至2 ml（濃度為10 mg/ml），取稀釋液0.1ml加細菌內毒素檢查用水至2.0 ml（濃度為0.5 mg/ml），取稀釋液0.3 ml加細菌內毒素檢查用水至2.5 ml（濃度為0.060 mg/ml），取稀釋液0.5 ml加細菌內毒素檢查用水至1.0 ml（濃度為0.030 mg/ml），取濃度為0.06 mg/ml的稀釋液0.2 ml加細菌內毒素檢查用水至0.6 ml（濃度為0.020 mg/ml），取濃度為0.06 mg/ml的稀釋液0.4 ml加細菌內毒素檢查用水至3.0 ml（濃度為0.008 mg/ml），取濃度為0.008 mg/ml的稀釋液0.5 ml加細菌內毒素檢查用水至1.0 ml（濃度為 0.004 mg/ml）。

試驗中另設陽性對照（PC）和陰性對照（NC），每個濃度平行做2管，結果見表1。

表1 供試品（批號：20100312）干擾預試驗結果

由表1可見供試品在各個稀釋濃度對鱟試劑檢查均無干擾作用。

2.5 供試品干擾試驗

取同一廠家的3批注射用法莫替丁，用細菌內毒素檢查用水進行稀釋，終濃度為0.017 mg/ml，選用兩個廠家靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行干擾試驗，結果見表2。

由表2可以看出，Es值均落在0.5λ～2.0λ之間 （λ為所選用鱟試劑的靈敏度，取值0.125 EU/ml），且相應的Et/Es比值均在0.5～2.0之間；這一結果說明注射用法莫替丁在稀釋濃度為0.017 mg/ml或更小時對細菌內毒素檢查無干擾作用。

表2 干擾試驗結果

2.6 供試品細菌內毒素檢查

本品共17批，按 《中國藥典》2010年版二部附錄XI E“細菌內毒素檢查法”[2]，分別進行細菌內毒素檢查，結果見表3。

由表3可見供試品注射用法莫替丁在稀釋至濃度為0.017 mg/ml及以下時對細菌內毒素檢查無干擾作用。本研究中將注射用法莫替丁的細菌內毒素檢查限值定為：每毫克法莫替丁中含內毒素的量應小于7.5 EU。對17批樣品分別按擬訂標準進行檢驗，其細菌內毒素檢查結果均符合規定。

3 討論

注射劑安全評價中是否可用細菌內毒素檢查實驗來檢測其熱原質，應視該注射劑對細菌內毒素實驗是否存在干擾及這種干擾能否排除的情況而定[3-7]。由試驗結果可見，注射用法莫替丁在稀釋至濃度為0.017 mg/ml時對上述兩個廠家的鱟試劑和細菌內毒素標準品之間的反應均無干擾作用。

一般情況下，供試品對細菌內毒素檢查的干擾作用程度與供試品濃度呈正性相關[4]。由本研究結果可見注射用法莫替丁在稀釋濃度為0.060 mg/ml時對細菌內毒素檢查無干擾作用。若將內毒素限值擬定為7.5 EU/mg，選用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行細菌內毒素檢查，則供試品的最小有效稀釋濃度為0.017 mg/ml。由于供試品對細菌內毒素檢查的干擾作用程度與供試品濃度呈正性相關[8-10]，本供試品在進行細菌內毒素檢查時可稀釋的濃度范圍較大，進而證實了本研究中所用方法的可靠性與可行性。

本研究針對國家藥典委員會《關于注射劑標準起草與復核工作的要求》對注射用法莫替丁的現行標準進行了提高工作，進一步減小了本品種細菌內毒素檢查的限值。注射用法莫替丁原質量標準載于國家食品藥品監督管理局國家藥品標準[WS1-（X-040）-2004Z]，該標準中規定注射用法莫替丁的細菌內毒素限值為每毫克中含內毒素的量應小于15 EU。本研究根據注射用法莫替丁最大臨床日用量，確定其細菌內毒素限值為每毫克法莫替丁中含內毒素的量應小于7.5 EU，并對哈藥集團三精加濱藥業有限公司生產的3批注射用法莫替丁進行了細菌內毒素檢查干擾試驗，結合對樣品的檢驗結果，擬定了注射用法莫替丁的細菌內毒素檢查標準。對內毒素限值的進一步提高，有利于更好地控制藥品質量，為醫院用藥安全提供更高的保障。

表3 注射用法莫替丁細菌內毒素檢查結果

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