耐亞胺培南銅綠假單胞菌的臨床分離及耐藥機(jī)制分析

廉 婕 ，麥麗文 ，余治健 ，鄧啟文 *

1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518052；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院感染科，廣東深圳 518052

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PAE）是引起醫(yī)院感染的最常見(jiàn)條件致病菌之一，對(duì)多種抗生素天然或獲得性耐藥，一直是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。亞胺培南等碳青霉烯類抗生素由于抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)，已成為目前治療多重耐藥銅綠假單胞菌最有效的抗生素。但隨著該類抗生素臨床應(yīng)用的逐漸增多，出現(xiàn)了大量的耐亞胺培南菌株（imipenem-resistant pseudomonas aeruginosa，IRPA），給臨床治療帶來(lái)了極大困難。因此，加強(qiáng)對(duì)IRPA的研究，為臨床有效控制其感染提供科學(xué)依據(jù)顯得尤為重要。為了解深圳地區(qū)IRPA的耐藥情況和耐藥機(jī)制，作者收集了廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院2009年1月～2010年12月住院患者臨床標(biāo)本中分離的IRPA進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源與質(zhì)控菌株 404株銅綠假單胞菌分離于我院2009年1月～2010年12月住院部各科患者的各類臨床標(biāo)本（包括痰液、尿液、傷口分泌物、膿液、血液等），同一患者的同一部位連續(xù)分離的多株銅綠假單胞菌以1株計(jì)算。金屬酶IMP基因陽(yáng)性菌株P(guān)A987由廣州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院卓超教授提供。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922，購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 PCR引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)MBL基因型IMP、VIM、GIM、SPM以及通道蛋白基因oprD2的擴(kuò)增引物，由上海生物工程有限公司合成，引物序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度詳見(jiàn)表1。

表1 耐藥基因PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及分離 臨床送檢的各類標(biāo)本嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)。分純后的銅綠假單胞菌用小牛血清保存至-80℃冰箱待用。

1.2.2 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)方法 所有菌株均以BD Phoenix100全自動(dòng)微生物分析儀鑒定到種，必要時(shí)采用梅里埃ATBExpression半自動(dòng)細(xì)菌分析儀補(bǔ)充鑒定。藥敏試驗(yàn)采用BD Phoenix 100革蘭陰性細(xì)菌配套藥敏試驗(yàn)復(fù)合板，包括阿米卡星、阿莫西林/克拉維斯、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、美洛培南、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、四環(huán)素、復(fù)方磺胺、多粘菌素E，共20種抗菌藥物。

1.2.3 基因擴(kuò)增 采用煮沸法提取模板DNA，oprD2基因擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 3 min,然后 95℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃60 s，循環(huán)35個(gè)周期，最后72℃延長(zhǎng)5 min；其余基因擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 3 min， 然后 95℃ 60 s→55℃ 60 s→72℃60 s，循環(huán)35個(gè)周期，最后 72℃延長(zhǎng)5 min。取PCR產(chǎn)物4 μg經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 使用DNA凝膠回收純化試劑盒（購(gòu)自TaKaRa）將PCR產(chǎn)物割膠純化，送至深圳華大基因測(cè)序，序列登錄GenBank進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 IRPA的分離率

從404株銅綠假單胞菌中檢出IRPA 100株，分離率為24.75%。其中大多數(shù)分離自痰液標(biāo)本90株，占90.0%，其次為血液和膿液標(biāo)本，均為3株，各占3.0%，分離自傷口分泌物和膽汁標(biāo)本均為2株，各占2.0%。

2.2 IRPA感染者科室分布

IRPA感染者主要來(lái)自重癥醫(yī)學(xué)科，占31.0%，其次為呼吸內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科，分別為20.0%和16.0%，具體科室分布情況見(jiàn)表2。

2.3 IRPA對(duì)抗菌藥物的耐藥性

100株亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌，對(duì)阿米卡星的耐藥率最低，為27.0%，耐藥率在30.0%～50.0%的有4種抗菌藥物：頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦；耐藥率在50.0%～70.0%的有4種抗菌藥物：氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢吡肟；對(duì)其余10種抗菌藥物的耐藥率均>70.0%，其中，氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉和氯霉素的耐藥率為100%。具體耐藥情況見(jiàn)表3。

表2 耐亞胺培南銅綠假單胞菌的科室分布情況

表3 耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥情況

2.4 MBL基因及oprD2基因檢測(cè)結(jié)果

100株IRPA中，檢測(cè)到IMP基因陽(yáng)性1株（PA47），陽(yáng)性率為1.0%，oprD2基因缺失65株（PA47為擴(kuò)增陽(yáng)性菌株），陽(yáng)性率為65.0%，其余耐藥基因（VIM、GIM、SPM）均未檢出。

2.5 IMP基因測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)PA47菌株的IMP基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行正向測(cè)序，經(jīng)Clustal W程序分析，其核酸序列與GenBank已登陸的blaIMP-9序列（登錄號(hào)：AY033653）的同源性為100%，可判定為IMP-9型基因。PA47_blaIMP在GenBank的登錄號(hào)為JN107561。

3 討論

近年來(lái)，由于化療、放療、免疫抑制劑及各類侵入性診療項(xiàng)目在臨床的廣泛開(kāi)展，非發(fā)酵類病原菌引起的醫(yī)院感染逐漸增多，其中銅綠假單胞菌分離量占首位（45.4%）[2]。碳青霉烯類抗生素（亞胺培南、美羅培南等）具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，已成為治療IRPA感染最有效的抗生素[3]。然而，隨著該類抗生素在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對(duì)它的耐藥率也呈不斷上升的趨勢(shì)，中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)道，1994～2001年中，銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥率由1994年的8.5%上升到2009 年的 30.5%[4-5]。

我院分離的銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥率為24.75%（100/404），90.0%的菌株從痰液中分離得到，表明耐亞胺培南的銅綠假單胞菌多引起呼吸道感染，是醫(yī)院獲得性肺炎的首位病因，這和國(guó)內(nèi)外諸多相關(guān)報(bào)道一致[6-8]。

在科室分布方面，我院耐亞胺培南銅綠假單胞菌多來(lái)自ICU（31.0%），這可能與患者多為急重癥或昏迷階段，免疫力低、病程和住院時(shí)間長(zhǎng)、有手術(shù)史以及較頻繁地大量使用廣譜抗菌藥物，造成菌群失調(diào)，易繼發(fā)感染銅綠假單胞菌，且長(zhǎng)時(shí)間在藥物選擇性壓力下，耐藥性菌株成為優(yōu)勢(shì)菌群，因此，這些科室分離的耐亞胺培南銅綠假單胞菌亦多為多重耐藥菌株。

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表3），100株IRPA中，對(duì)阿米卡星的敏感性最好（73.0%），其次是哌拉西林/他唑巴坦（63.0%）、哌拉西林（59.0%）、慶大霉素（58.0%）、頭孢他啶（57.0%），其余藥物的敏感率均<50.0%。100株IRPA對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、氯霉素全部耐藥。同處廣東地區(qū)，我院IRPA對(duì)氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素的耐藥率均<53.0%，而姚芬等[7]報(bào)道的耐藥率達(dá)到95%以上，這可能跟不同醫(yī)院臨床用藥習(xí)慣不同有關(guān)。由此可見(jiàn)，重視和加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)，優(yōu)先選用低耐藥可能性的抗生素，合理應(yīng)用廣譜抗生素，將有助于避免IRPA引起醫(yī)院感染流行。

銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制包括β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生、外膜通透性的降低和主動(dòng)外排系統(tǒng)的表達(dá)。金屬酶（metallo-β-lactamases，MBL）是一類能夠水解包括碳青酶烯類在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類藥物的β-內(nèi)酰胺酶，主要通過(guò)基因盒，整合子和轉(zhuǎn)座子的形式傳播。MBL包括四種類型：IMP型金屬酶，已報(bào)道的超過(guò)19種；VIM型金屬酶，已超過(guò)11種；SPM-1型金屬酶和GIM-1型金屬酶。MBL編碼基因多位于整合子上，其中以IMP型和VIM型 最為常見(jiàn)[1]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，2009年1月～2010年12月收集的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中僅發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)IMP型金屬酶菌株，提示產(chǎn)IMP型金屬酶是抗菌后效應(yīng)（PAE）對(duì)IMP耐藥的機(jī)制之一。另外，我院檢出的IMP型金屬酶經(jīng)分析為IMP-9型，具有該類型金屬酶的銅綠假單胞菌曾在2000年于廣州地區(qū)三家醫(yī)院爆發(fā)流行[9]，需引起我院醫(yī)院感染管理科的高度重視。

在β-內(nèi)酰胺類抗生素抑菌過(guò)程中，首先必須穿透銅綠假單胞菌的外膜進(jìn)入周漿間隙才能起作用，oprD2蛋白是目前所知的PAE外膜中唯一有助于抗生素通過(guò)的孔道蛋白，具有配體特異性，能形成亞胺培南的特異結(jié)合位點(diǎn)。一旦oprD2蛋白缺失，PAE對(duì)亞胺培南的MIC由1～2 mg/L上升至8～32 mg/L，而對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物影響并不大，所以碳青酶烯類抗菌藥物與其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性。一般認(rèn)為，oprD2孔道蛋白的缺失是PAE對(duì)亞胺培南耐藥的主要機(jī)制[10]，本實(shí)驗(yàn)中65%的IRPA未擴(kuò)增出oprD2基因，表明大多數(shù)菌株存在oprD2基因突變，導(dǎo)致oprD2表達(dá)減少或不表達(dá)，這可能是我院臨床分離銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的主要機(jī)制。

總之，IRPA對(duì)臨床常用抗生素耐藥情況非常嚴(yán)峻，PAE對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制復(fù)雜，產(chǎn)酶、孔道蛋白o(hù)prD2基因缺失以及外排泵出機(jī)制三者可單獨(dú)或同時(shí)存在。應(yīng)加強(qiáng)臨床細(xì)菌耐藥性的發(fā)生和發(fā)展的監(jiān)控，盡量獲得細(xì)菌學(xué)證據(jù)，并根據(jù)細(xì)菌的體外藥物敏感結(jié)果聯(lián)合選用抗生素。另外，未來(lái)這類產(chǎn)酶銅綠假單胞菌可能會(huì)引起醫(yī)院感染的暴發(fā)和流行，必須加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)。

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