丙型肝炎患者生化變量與細胞因子間的相關性分析

由莉越 ，遲淑萍 ，汪 辰 ，孫 杰 ，周婷婷 ，陳紅鴿 ，趙慶國 ，程 云 *

1.解放軍第三〇二醫院藥學部，北京 100039；2.軍事醫學科學院基礎醫學研究所，北京 100850

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）所引起，是危害人類健康的重要疾病之一，其中有很大一部分患者最終發展為肝硬化和肝癌[1]。長期以來，對于丙型肝炎慢性化和肝損傷的機制一直都在探討之中[2]，在丙型肝炎的診斷和預后效果判斷的過程中，肝生化指標的測定結果具有很重要的參考價值。此外，細胞因子重組人干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、 腫瘤壞死因子 α （tumor necrosis factor，TNF-α）、重組人白介素10（interleukin-10，IL-10）都是細胞免疫應答過程中合成分泌的細胞因子，它們同其他細胞因子形成細胞因子網絡，對免疫應答進行調節，同時也參與炎癥反應，是重要的炎癥介質。本研究采用酶聯接免疫吸附劑測定（ELISA）方法檢測丙型肝炎患者血清中IFN-γ、IL-10、TNF-α的表達水平，探討3種細胞因子之間以及其與生化變量之間的相關性，有助于進一步了解HCV引起肝臟損傷的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

慢性HCV感染者的66份外周血均采自解放軍第三〇二醫院2005年1月～2006年1月的住院確診的患者。其中，男32 例，女 34例；年齡 7～77 歲，平均（51.5±18.5）歲；27 例有輸血史。HCV感染的診斷根據血清抗-HCV和（或）HCV RNA檢測陽性。按照2005年第11次全國病毒性肝炎會議修訂的診斷標準，將患者分為輕度慢性肝炎33例，中重度慢性肝炎8例，代償期肝硬變13例，失代償期肝硬變12例。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞（PBMC）提取后，將分離所得PBMCs用含有100 ml/L的混合人血清的完全RPMI 1640培養，稀釋細胞使其終濃度為5×107/ml，以100 μl/孔加入96孔板，37℃、5%CO2孵箱中培養，72 h后收集培養上清，采用ELISA方法檢測上清細胞因子IFN、IL-10、TNF-α的含量。操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 以患者血清為模板，提取HCV RNA進行逆轉錄，然后在AG-600型DNA擴增儀上進行兩輪巢式PCR循環，具體的PCR引物以及擴增條件參考我院之前的研究結果[3]，最后利用PE 310全自動遺傳分析儀進行序列測定。

1.3 統計學方法

使用SPSS 13.0統計學軟件對各生化變量之間、各細胞因子之間以及各生化變量與各細胞因子之間的相關性進行皮爾森（Pearson）相關性分析。統計結果相關系數≥0.8，高相關性；0.5≤相關系數<0.8，中相關性；0.3≤相關系數<0.5，低相關性；相關系數<0.3，非常低相關性，可以認為不相關。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生化指標檢測結果

本研究共檢測生化指標8項，其中丙氨酸氨基轉換酶（ALT）、 天門冬酸氨基轉換酶 （AST）、ALT/AST、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、清蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）七項指標檢測了66例患者，CHE指標檢測了46例患者，各變量檢測結果，計量資料以均數±標準差（）表示。各指標檢測結果如下：ALT（81.0±72.4）U/L、AST（65.2±46.5）U/L、ALT/AST（0.95±0.47）、TBIL（12.95±6.31）U/L、DBIL（3.09±2.16）U/L、ALB（44.14±3.03）U/L、GLO（30.24±5.78）U/L、CHE（7108.6±1724.3）U/L。

2.2 細胞因子檢測結果

在本研究中檢測了3種細胞因子的表達水平，66例患者中有34例檢測了細胞因子IFN-γ及IL-10表達水平，同時該34例患者中有33例同時檢測了細胞因子TNF-α的表達水平。結果顯示IFN-γ表達的平均水平為（76.9±112.3）ng/L，IL-10 表達的平均水平為（1596.4±1313.4）ng/L，TNF-α 平均表達水平為（4253.8±4557.4）ng/L。

2.3 各生化變量與細胞因子間的相關性分析

各生化變量與細胞因子間的相關性較差，除GLO與TNF-α在 0.05置信水平上有較低相關性 （r=-0.287，P=0.046）之外（圖1），丙肝患者各血生化指標與各炎癥細胞因子之間無顯著相關性（P＜0.05）。

圖1 GLO-TNF相關性散點圖

2.4 各生化指標之間的相關性分析

通過各生化指標之間的相關性分析可以看出各指標之間存在微弱互相關性。其中ALT與AST具有顯著相關性（r=0.869，P=0），但是做除法后（ALT/AST）相關性基本被消除，僅存在ALT與ALT/AST的中度相關（r=-0.370，P=0.002）。另外，ALT與GLO在0.05水平正相關，但是相關性非常低 （r=0.283，P=0.021）。對于AST而言，除了與ALT高度相關之外，還與 DBIL（r=0.281，P=0.022）和 GLO（r=0.427，P=0）具有相關性；對于ALT/AST而言，除與ALT中度相關外，還與CHE在0.01 水平呈負相關（r=-0.417，P=0.004），但相關性低；對于TBIL 而言，與 DBIL 在 0.01水平呈正相關（r=0.732，P=0），且為中度相關性；對于ALB而言，與GLO在0.01水平呈負相關（r=-0.461，P=0），且相關性低。

2.5 細胞因子間的相關性分析

細胞因子間的相關性分析顯示除IFN-γ與TNF-α之間存在弱相關性（r=0.448，P=0.009）之外（圖 2），各細胞因子表達水平之間無明顯相關性（P＜0.05）。

3 討論

圖2 IFN-TNF相關性散點圖

丙型肝炎是由丙肝病毒所引發，通過輸血或血制品、血透析、腎移植、靜脈注射毒品、性傳播、母嬰傳播等傳染引起的。有研究證明，HCV感染者病程進展與諸多因素有關，包括性別、感染HCV的年齡、過度飲酒、脂肪變性、合并感染HBV/HIV、免疫抑制（如器官移植）等[4-5]。在臨床診斷其疾病以及疾病發展過程中，肝功能檢查是很重要的一項判斷指標。Zechini等[6]認為，ALT水平，特別是AST的水平，與肝損傷的程度有關。而有研究[7]則認為，肝損傷程度與臨床癥狀、ALT水平、HCV基因型和病毒載量不相關。Anand等[8]和Rehermann[9]報道在慢性丙型肝炎患者中AST/ALT比值是判斷纖維化分期和肝硬化的一個獨立指標，當AST/ALT≥1時，高度提示肝硬化的存在。慢性肝炎中度以上、肝硬化、重型肝炎時出現白蛋白下降，γ球蛋白升高，白/球（A/G）比例下降甚至倒置。一般情況下，肝損程度與膽紅素含量呈正相關。DBIL在TBIL中的比例尚可反映淤膽程度。本研究中，對各生化變量之間進行相關性分析后，除了ALT與AST具有高顯著相關性之外，其余的生化變量之間存在弱的相關性，而且在對ALT、AST做除法后（ALT/AST）相關性基本被消除，這就提示在對疾病作判斷時不能單純地看某一指標，必須綜合考慮。

以往的研究認為慢性丙型肝炎肝損傷的發病機制是HCV與宿主免疫反應之間相互作用的結果[9]。細胞免疫在HCV感染中具有雙重作用，HCV感染機體后，誘導機體產生的Th1類細胞因子，其中就包括IFN-γ和TNF-α，這兩種細胞因子同時具有抗病毒和誘發炎癥的作用，雖然不足以清除病毒，但仍可誘導機體的肝臟損傷[10]。Yoshioka等[11]研究發現，過量的TNF與暴發型病毒性肝炎和慢性活動性肝炎相關，其本身對感染的肝細胞也有直接的溶解破壞作用。以往的研究也顯示，IFN-γ在清除病毒中起重要作用，TNF-α是引起肝臟損傷的重要因素之一[12]。IL-10屬于細胞因子中的干擾素家族，最初認為是由Th2淋巴細胞分泌的，能抑制 Th1 細胞合成 IFN-γ、白介素 2（interleukin-2，IL-2），故曾被命名為細胞因子合成抑制因子 （cytokine synthesis inhibiting factor，CSIF）。IL-10也能抑制炎癥因子的合成與釋放，de Waal等[13]發現，內源性與外源性IL-10均能在轉錄水平強烈抑制 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 的合成，從而起到抗炎癥的作用。本研究發現，IFN與TNF之間存在弱相關性，而且球蛋白（GLO）與TNF在0.05置信水平上有較低相關性。提示IFN與TNF可以相互誘導表達，以促進HCV的清除，同時，TNF的表達引起肝臟損害的機制可能是通過GLO這個生化指標表現出來。為了更好地分析各生化變量及細胞因子之間的關系，下一步筆者將擴大樣品數，以進行更深入細致的分析。

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