厄貝沙坦血漿蛋白結(jié)合率測定

李 寅 ，陳鳳儀 ， 張國添 ，楊 輝 ， 黃玉玲 ，謝清春 ，鐘 鳴

1.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東廣州 511400；2.廣東藥學院藥物研究所，廣東廣州 510006；3.廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司，廣東廣州 510240

厄貝沙坦（Irbesartan）是血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體拮抗劑，能特異性地拮抗血管緊張素Ⅱ受體（AT1），通過特異性地拮抗AngⅡ與AT1受體的結(jié)合，抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產(chǎn)生降壓作用，臨床上主要用于高血壓的治療，同時厄貝沙坦在歐盟獲準用于一個新的適應證，即治療有高血壓的2型糖尿病患者的腎臟病，是歐盟批準用于預防糖尿病早期及晚期腎臟疾病的第一個抗高血壓藥。

針對高血壓患者血壓有明顯的晝夜節(jié)律改變，本課題組采用雙層凝膠骨架片技術制備得到厄貝沙坦緩釋片，該緩釋片能有效控制厄貝沙坦在體內(nèi)的釋放過程，可以使藥物在體內(nèi)緩慢發(fā)揮持續(xù)、穩(wěn)定的降壓作用，并能減少由血藥濃度突然增高而引起的不良反應的發(fā)生，實現(xiàn)夜間平穩(wěn)降壓。根據(jù)《藥品注冊管理辦法》及《化學藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》要求，必須對厄貝沙坦緩釋片進行藥代動力學研究，而“藥物與血漿蛋白的結(jié)合”是主要研究內(nèi)容之一。國內(nèi)外未見厄貝沙坦的血漿蛋白結(jié)合率的相關研究報道，而藥物的臨床療效和毒性反應與藥物的蛋白結(jié)合力和結(jié)合率密切相關。因此，筆者對厄貝沙坦的血漿蛋白結(jié)合率進行研究[1-5]，為申報厄貝沙坦緩釋片新藥提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Sartorius BA110S電子天平（德國Sartorius公司）；Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀 （Dionex公司）；THZ-82型恒溫水浴振蕩器（江蘇金壇市宏華儀器廠）；XH-C旋渦混合器（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；SB 4200DTS型雙頻超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份超聲儀器有限公司）；透析卡（0.5～3.0 ml，美國 Pierce Biotechnology 公司）。

1.2 材料

厄貝沙坦 （深圳邁瑞爾化學技術有限公司，批號：M-1007L08）；厄貝沙坦對照品（深圳邁瑞爾化學技術有限公司，含量99.75%）；氯雷他定（深圳邁瑞爾化學技術有限公司，含量99.83%）。乙腈（色譜純，依能色譜有限公司）；其他試劑均為分析純，購自廣州化學試劑廠。健康人空白血漿由廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱為 Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液（磷酸調(diào)pH至2.6）（45∶55）；流速為 1 ml/min；檢測波長為 245 nm；柱溫為 35℃；進樣量為20 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)按厄貝沙坦峰計不低于3000。

2.1.2 溶液配制

2.1.2.1 空白透析液 精密稱取磷酸氫二鉀14.110 g，磷酸二氫鉀2.592 g，氯化鈉1.991 g，置于1000 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，制成pH=7.4的緩沖液，即得。

2.1.2.2 厄貝沙坦儲備液 稱取105℃干燥至恒重的厄貝沙坦適量，精密稱定，加空白透析液制成每1 ml含厄貝沙坦100 μg/ml的儲備液，置4℃冰箱中冷藏備用。

2.1.2.3 供標準曲線用厄貝沙坦標準溶液 精密稱取105℃干燥至恒重的厄貝沙坦對照品3.12 mg，置100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為31.20 μg/ml的對照品儲備溶液。精密吸取上述對照品儲備溶液0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ml分別置于 50 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，即得。制得濃度為0.31、0.62、1.25、2.50、6.24、12.48、31.20 μg/ml的對照品溶液。

2.1.2.4 供透析用厄貝沙坦溶液 吸取上述厄貝沙坦儲備液適量，加空白透析液制成濃度分別為0.2、2.0、20.0 μg/ml的厄貝沙坦溶液，置4℃冰箱中冷藏備用。

2.1.2.5 內(nèi)標溶液 稱取氯雷他定適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含氯雷他定10 μg/ml的對照品溶液，置4℃冰箱中冷藏備用。

2.1.3 透析液樣品處理

精密吸取透析內(nèi)液或透析外液100 μl，加內(nèi)標溶液10 μl，渦旋混合 2 min，加入乙腈 100 μl，渦旋混合 2 min，離心（16000 r/min）10 min，取上清液，置 50℃水浴，氮氣吹干，殘渣加流動相 100 μl，渦旋混合 6 min，離心（16000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.1.4 透析液分析方法驗證

2.1.4.1 專屬性 在上述色譜條件下，厄貝沙坦和內(nèi)標的保留時間分別為6.03、10.12 min，血漿中其他成分對測定無干擾。

2.1.4.2 標準曲線和線性范圍 精密吸取空白血漿或空白透析液200 μl，加供分析方法驗證用厄貝沙坦標準溶100 μl，制成厄貝沙坦?jié)舛确謩e為 0.10、0.21、0.42、0.83、2.08、4.16、10.40 μg/ml的標準樣品溶液，按“透析液樣品處理”項處理，注入色譜儀，測定峰面積。以厄貝沙坦與內(nèi)標的面積比為縱坐標（Y），厄貝沙坦?jié)舛葹闄M坐標（C），線性回歸。透析內(nèi)液的線性方程為：Y=0.9245C+0.0256（r=0.9990）線性范圍為0.10～10.40 μg/ml，定量下限為 0.10 μg/ml；透析外液的線性方程為：Y=0.8449C+0.0584（r=0.9996）線性范圍為0.10～10.40 μg/ml，定量下限為 0.10 μg/ml。

2.1.4.3 精密度 精密吸取空白血漿或空白透析液200 μl，加厄貝沙坦儲備液，制成低、中、高三個濃度的溶液（濃度分別為 0.2、2.0、20.0 μg/ml），按“透析液樣品處理”項處理，注入色譜儀，測定峰面積。在同一天內(nèi)連續(xù)進樣5次及連續(xù)3 d測定，分計算日內(nèi)精密度與日間精密度。結(jié)果顯示，血漿樣品高、中、低三個濃度的平均回收率分別為（99.1±8.2）%、（95.7±7.7）%、（102.4±9.8）%， 日內(nèi)精密度分別為 5.27%、6.32%、6.88%，日間精密度分別為6.46%、6.73%、7.11%；透析外液樣品高、中、低三個濃度的平均回收率分別為（99.7±3.2）%、（98.5±4.3）%、（99.6±4.1）%， 日內(nèi)精密度分別為 3.22%、3.36%、3.07%，日間精密度分別為3.86%、4.13%、4.40%。

2.1.4.4 提取回收率 取“精密度”項低、中、高三個濃度的標準血漿樣品溶液（濃度分別為 0.2、2.0、20.0 μg/ml），每個濃度5份，按“透析液樣品處理”項處理，依法測定峰面積（A1）。另取以甲醇稀釋的相應濃度對照品溶液，測定峰面積（A2）。按下式計算提取回收率（F）：F=（A1/A2）×100%。 結(jié)果顯示，高中低 3種濃度的提取回收率分別是 （80.9±7.4）%、（83.2±6.7）%、（78.4±6.6）%。

2.1.4.5 反復凍融穩(wěn)定性 將“標準曲線和線性范圍”項的標準血漿樣品作為質(zhì)控樣品，進行冰凍融溶實驗。樣品置-20℃冰箱中反復3次凍融 （分別于第1、3、7天融溶），室溫融溶后，依法測定樣品濃度，每個濃度重復5份。結(jié)果顯示，測定值與理論值的相對誤差RSD<10%，表明血漿樣品在-20℃下可穩(wěn)定保存。

2.1.4.6 室溫穩(wěn)定性 取“反復凍融穩(wěn)定性”項下的融溶樣品處理后的進樣測定前的分析液，室溫下放置2、4、8、12 h，在上述時間點取樣，依法測定濃度。結(jié)果顯示，分析液室溫放置12 h不影響含量測定。

2.2 血漿蛋白結(jié)合率實驗

采用平衡透析法[6]測定厄貝沙坦的血漿蛋白結(jié)合率。吸取空白血漿2.0 ml注入處理好的透析卡中，置于200 ml不同濃度厄貝沙坦透析液（濃度分別為 0.2、2.0、20.0 μg/ml，平行3 份）的燒杯中，（37±1）℃平衡透析，分別于 4、8、12、18、24、30 h吸取卡外透析液適量，置試管中加熱至沸騰，再滴加5%乙酸檢視，應無白色渾濁現(xiàn)象。取出卡內(nèi)血漿，按“透析液樣品處理”項處理，分別測定卡內(nèi)血漿（C1）及卡外透析液（C2）中厄貝沙坦的濃度。按下式計算不同藥物濃度水平的血漿蛋白結(jié)合率：血漿蛋白結(jié)合率（%）=（C1-C2）/C1×100%。 結(jié)果見表 1。

表1 厄貝沙坦血漿蛋白結(jié)合率（%）

3 討論

對厄貝沙坦及輔料在釋放介質(zhì)中的UV吸收特征進行考察，由掃描結(jié)果可知，厄貝沙坦溶液在245 nm處有一吸收肩峰，而輔料溶液在該波長處沒有吸收，不干擾測定，所以選擇245 nm作為檢測波長。

實驗中先后采用了不同比例的甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-磷酸二氫鉀水溶液等作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用上述流動相，厄貝沙坦色譜峰均有不同程度的拖尾。采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至 2.60）（45∶55）為流動相，所得峰形和分離度較好。

厄貝沙坦的血漿蛋白結(jié)合率測定結(jié)果顯示，該藥物屬于高蛋白結(jié)合率的藥物（血漿蛋白結(jié)合率>90%）。提示，在臨床聯(lián)合用藥中，應注意該藥與其他高蛋白結(jié)合率的藥物的使用，有可能會導致一些不良反應。

[1]鹿秀梅,江坤,于霄,等.川丁特羅與人血漿蛋白結(jié)合率的測定[J].中國新藥與臨床雜志,2010,29(7):524-528.

[2]李秋紅,崔明宇,隋曉璠,等.丁香苦苷血漿蛋白結(jié)合率的測定[J].哈爾濱商業(yè)大學學報:自然科學版,2008,24(2):148-150.

[3]姚志紅,曹秀珍,邵萌,等.超濾法測定甲基原薯蕷皂苷的血漿蛋白結(jié)合率[J].中國中藥雜志,2008,33(11):1291-1294.

[4]丁一冰,樊夏雷,沈建平,等.Cap-HPLC測定人血漿中厄貝沙坦和氫氯噻嗪濃度及其復方制劑的生物等效性研究[J].中國藥科大學學報,2005,36(6):551-555.

[5]葉勇,周莉玲,晏亦林,等.超濾法測定磷酸川芎嗪的血漿蛋白結(jié)合率[J].中藥材,2010,33(8):1282-1285.

[6]石珊,趙云麗,于治國.雙氯芬酸鈉人血漿蛋白結(jié)合率的測定[J].山西醫(yī)藥雜志,2010,39(7):667-668.