高效液相色譜法測定健脾益腎顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的含量

劉俊娥，劉俊紅，趙鐵彥

1.北京軍區總醫院營養科，北京 100700；2.山西省太原二六四醫院輸血科，山西太原 030001；3.山西省太原二六四醫院普外科，山西太原 030001

健脾益腎顆粒為中藥復方制劑，由補骨脂、黨參、枸杞子、女貞子、菟絲子和白術等多味中藥組成，具有健脾益腎的功效，能提高機體免疫力、抑制腫瘤的雙向調節作用，減輕放化療等副作用以及減輕脾腎虛弱所引起的疾病。補骨脂為處方中的君藥，其有效成分為補骨脂素和異補骨脂素。文獻中多采用高效液相色譜法[1-2]、氣相色譜法[3]、薄層掃描法[4]和毛細管電泳法[5]等來測定其有效成分的含量。為了更有效地控制健脾益腎顆粒的質量，本文采用高效液相色譜法測定健脾益腎顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的含量，并進行學研究，簡便可靠，重復性好，能有效控制產品的質量。

1 儀器與試藥

Agilent 1200液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，包括：四元泵、在線脫氣器、Chem station色譜工作站）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

補骨脂素和異補骨脂素對照品（中國藥品生物制品檢定所），健脾益腎顆粒（北京長城制藥，批號：060233）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（53∶47）；檢測波長：246 nm；流速：1 ml/min。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定補骨脂素和異補骨脂素對照品適量，加甲醇制成每毫升含20.22 μg和20.50 μg的補骨脂素和異補骨脂素溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取健脾益腎顆粒5 g，研細，精密稱取1 g，置具塞錐形瓶中，加入適量甲醇，超聲30 min，放冷，濾過，濾液置于25 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續濾液即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方組成，取不含補骨脂的諸藥，按“2.3”項下的方法制成陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件測定補骨脂素和異補骨脂素對照品、陰性對照及供試品溶液色譜圖。結果表明，其他成分對補骨脂素和異補骨脂素測定無干擾。見圖1。

圖1 健脾益腎顆粒中補骨脂素和異補骨脂素含量測定的高效液相色譜

2.5 線性關系考察

精密吸取不同體積的上述補骨脂素和異補骨脂素的對照品混合溶液。按“2.1”色譜條件分別進樣，測定其峰面積。以峰面積Y為縱坐標，補骨脂素和異補骨脂素的進樣量X（μg）為橫坐標，進行線性回歸，得補骨脂素的回歸方程為Y=80.05X+1.452，r=0.9999；異補骨脂素的回歸方程為 Y=78.26X+2.653，r=0.9999。 表明，補骨脂素在 0.04010～0.20480 μg范圍內呈良好的線性關系，異補骨脂素在0.03422～0.21200 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.6 穩定性試驗

取供試品溶液分別在 0、2、4、6、8 h測定補骨脂素和異補骨脂素的含量。補骨脂素、異補骨脂素含量的RSD值分別為0.52%、0.67%。測定結果表明，供試品溶液在8 h內基本穩定，補骨脂素和異補骨脂素含量無明顯變化，被測組分化學性質穩定。

2.7 精密度試驗

精密吸取補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液，分別連續進樣5次，計算相對標準偏差。補骨脂素、異補骨脂素含量的RSD值分別為0.38%、0.25%。測定結果表明，方法精密度良好。

2.8 重現性試驗

取同一批健脾益腎顆粒5份，制備方法同“2.3”項下方法，依次測定補骨脂素和異補骨脂素的含量。補骨脂素、異補骨脂素含量的RSD值分別為0.82%、0.95%。測定結果表明，該方法重現性良好。

2.9 加樣回收試驗

采用加樣回收法，精密量取已知含量的補骨脂素和異補骨脂素供試品溶液，共5份，分別精密加入一定量的補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液，制備方法同“2.3”項下方法，依次測定補骨脂素和異補骨脂素的含量，計算回收率。其中回收率=（檢出補骨脂素或異補骨脂素量-樣品中補骨脂素或異補骨脂素量）/加入補骨脂素或異補骨脂素量×100%。結果顯示，補骨脂素和異補骨脂素的平均回收率分別99.8%、100.1%，RSD值分別1.00%、0.87%。測定結果見表1、2。

表1 補骨脂素加樣回收率試驗（μg）

表2 異補骨脂素加樣回收率試驗（μg）

2.10 樣品含量測定

取三批樣品，制備方法同“2.3”項下方法，連續進樣5次，分別測定補骨脂素和異補骨脂素的含量。三批樣品中補骨脂素和異補骨脂素含量見表3。

表3 樣品中補骨脂素和異補骨脂素含量測定結果（n=5）

3 討論

通過對索氏提取法和超聲提取法的比較，結果表明，兩種方法測得的補骨脂素和異補骨脂素含量無明顯差異，因超聲提取法方便，可操作性強，所以本實驗選用超聲提取法。同時通過預試，發現提取溶劑選擇甲醇比較合適。分別考察了甲醇-水、乙腈-水等不同比例的流動相，結果顯示，乙腈-水（53∶47）為流動相分離度更好，峰形對稱，保留時間適宜，所以確定乙腈-水（53∶47）為流動相。

本研究所用的測量健脾益腎顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的定量分析方法，結果準確，重現性好，可作為控制該制劑質量的手段之一。

[1]郝旭亮,劉霞,倪燕,等.HPLC測定益腎康膠囊中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J].中國中藥雜志,2006,31(17):1472-1473.

[2]李振國,李忠保,王海波.HPLC法測定仙靈骨葆顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J].中醫研究,2009,22(1):25-26.

[3]馬虹英.GC法測定補骨脂酊中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J].中國藥房,2010,21(23):2170-2171.

[4]蘆喜珍,彭瑩,高濤.薄層掃描法測定速效生發噴霧劑中補骨脂有效成分的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2005,11(1):14-15.

[5]葉靜,肖美添,黃雅燕,等.膠束毛細管電泳測定補骨脂藥材中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J].藥物分析學雜志,2008,28(9):1531-1534.