高效液相色譜法測定苯妥英鈉血藥濃度

左 晶，宋新文，汪 洋，許 瓊，劉 炘

湖北省武漢市兒童醫院藥學部，湖北武漢 430016

苯妥英鈉是臨床上應用最廣泛的抗癲癇藥物之一，其抗癲癇效應顯著而鎮靜作用輕微。但本藥屬于飽和代謝動力學藥物，用量的輕微增加就可引起血藥濃度的顯著上升，臨床應用不易掌握劑量，必須進行血藥濃度監測[1]。高效液相色譜法測定苯妥英鈉血藥濃度已有報道[2-4]，但大多提取過程繁鎖費時，色譜條件不太令人滿意。為此本文建立了一種簡便、快速、準確的高效液相色譜法測定苯妥英鈉血藥濃度，現報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，包括G1311A-四元泵、G13222－脫氣機、G1313A-柱溫箱；G1314A-UV紫外檢測器、HP化學工作站（美國HP公司）；WH-1微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；LDZ4-0.8A臺式離心機（北京醫用離心機廠）；AB204萬分之一電子分析天平（瑞士產）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

圖1 空白血清、血清樣品及苯妥英鈉對照品溶液高效液相色譜圖

1.2 試藥

苯妥英鈉對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100210-200401）；乙醚為分析純（上海馬陸制藥廠，批號：20110615，經重蒸后使用）；6 mol/L硫酸溶液（實驗室自制，批號：100307）；滅菌蒸餾水（安徽雙鶴藥業有限公司，批號：1010234C）；甲醇為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20110509）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Hypersil C18（4.6 mm×200 mm，10 μm）；流動相為甲醇-水（50∶50）；流速為 0.8 ml/min；柱溫為 30℃；檢測波長為230 nm；進樣量為20 μl。在該色譜條件下，色譜峰與血清中內源性雜質峰很好分離，無干擾峰出現，苯妥英鈉的保留時間為9.5 min左右。空白血清、血清樣品及苯妥英鈉對照液色譜圖，見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取苯妥英鈉對照品16.0 mg置10 ml容量瓶中，加滅菌蒸餾水溶解并稀釋至刻度，得1600 μg/ml儲備液。再按照倍比稀釋原則，用滅菌蒸餾水配制濃度分別為800、400、200、100、50、25 μg/ml的系列苯妥英鈉對照品溶液。

2.3 血清樣品處理

量取血清 0.25 ml，加入 3 μl、6 mol/L 硫酸溶液，混勻，再加入3 ml重蒸乙醚漩渦混合后于3000 r/min離心2 min，吸取乙醚，如此操作2次，合并乙醚，置40℃水浴中蒸干，殘渣用 0.25 ml、50%甲醇復溶后，取 20 μl進樣測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線制備 取空白血清1.0 ml，依次加入苯妥英鈉系列對照品溶液及儲備液0.1 ml，配制成苯妥英鈉濃度分別為 2.27、4.54、9.09、18.18、36.36、72.72、145.45 mg/L 的系列工作血清樣品。取以上工作血清，按“2.3”樣品處理項下的方法操作，取20 μl進樣測定，記錄色譜圖，以樣品的濃度（C）對峰面積（A）進行線性回歸，得回歸方程：C=0.0666A-0.9533（r=0.9990）。結果表明，苯妥英鈉血藥濃度在2.00～150.00 mg/L范圍內線性關系良好。最低定量濃度為2.00 mg/L。

2.4.2 穩定性試驗 取苯妥英鈉對照液分別于 0、8、24、48、72、96、120 h進樣測定，結果色譜峰面積RSD為0.47%，表明苯妥英鈉對照液在120 h（5 d）內是穩定的。

2.4.3 加樣回收率試驗 取空白血清1.0 ml，加入0.1 ml苯妥英鈉對照水溶液，配制成低、中、高濃度分別為8.33、33.33、100.00 mg/L苯妥英鈉血清樣品各3份，按“2.3”項下樣品處理的方法操作，每日取各濃度樣品3份，連續測定3 d，以標準曲線方程計算樣品實測濃度，與配制濃度比較，計算低、中、高各濃度加樣回收率及其日內、日間精密度。見表1。

表1 苯妥英鈉血清加樣回收率試驗結果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

文獻[2]、[3]、[4]分別采用 211、254、203 nm 作為檢測波長，但低波長（203、211 nm）處由于接近甲醇的截止波長，容易產生基線漂移和較大的背景吸收。采用254 nm作為檢測波長，苯妥英鈉的吸收度稍小，故本實驗采用230 nm作為檢測波長。

3.2 提取溶劑的選擇

吳宏衛等[2]采用在血清中加入磷酸鹽緩沖液后再用氯仿∶異丙醇（9∶1）提取，林建設等[3]直接用乙酸乙酯提取血清中苯妥英鈉，張丹等[4]于血漿中加入磷酸鹽緩沖液和氯化鈉后再用乙酸乙酯進行提取。由于氯仿和乙酸乙酯的沸點較高（分別為61℃和77℃），采用這兩種溶劑提取后均需在較高水浴溫度（60℃）及氮氣流下吹干，耗時較長。考慮到乙醚具有沸點低（35℃）、揮干時間短的特點，本實驗采用先加入酸性物質于血清中使苯妥英鈉轉化為苯妥因，再用重蒸乙醚進行提取的辦法。結果表明，血清中內源性雜質干擾少，提取回收率令人滿意，操作簡便。

[1]李家泰.臨床藥理學[M].3版.北京:人民衛生出版社,2007:1067-1068.

[2]吳宏衛,蔡琳,陳仁昊.重癥苯妥英鈉中毒的藥學監護[J].中國臨床藥學雜志,2006,15(6):382-384.

[3]林建設,文曉莉.反相高效液相色譜法測定人血清中苯妥英鈉濃度[J].中國藥師,2007,10(10):1016-1017.

[4]張丹,汪世英.反相高效液相色譜法同時測定血漿中苯妥英鈉及其主要代謝產物的濃度[J].華西藥學雜志,1995,10(1):25-28.