基于反相液相色譜的人血中茶堿濃度臨床檢測與分析

頓文亮 ，周 玉，高運軍，包貝華

1.江蘇省南京市中醫院藥劑科，江蘇南京 210001；2.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210029

茶堿是臨床上最常用的平喘藥之一，但茶堿的體內吸收和排泄個體差異很大，并且其有效范圍窄，易產生副作用，因此監測茶堿血藥濃度對臨床治療顯得非常必要[1]。目前HPLC是最常用方法之一，滿足臨床需要，本實驗結合文獻[2]，建立了快速、準確、簡便、經濟、重現性好的茶堿血藥濃度的HPLC檢測方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-10Avp高效液相色譜儀，LC-10ADVP雙泵，SPD-10Avp紫外檢測器，LC solution色譜工作站，Ts 0.5/20型超聲波電源，HP-01真空泵，1612-高速離心機，SK-1型快速混勻器，SC-230海爾冰箱，AL104電子天平。

1.2 藥品與試劑

茶堿（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：100121-199903）、咖啡因（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：171215-200809，含量為99.9%），甲醇為色譜純，實驗用水為超純水經微孔濾膜過濾。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（25∶75）（V/V）；檢測波長：274 nm；流速：1 ml/min；柱溫：30℃。

2.2 茶堿標準品溶液的制備

精密稱取茶堿標準品4.0 mg，甲醇溶解定容，配制成0.4 mg/ml的儲備液，臨用時用超純水稀釋到相應的濃度。

2.3 內標溶液的制備

精密稱取咖啡因3.0 mg，加入甲醇超聲溶解定容，配制成150 μg/ml的咖啡因溶液為內標。樣品均4℃保存備用。

2.4 血清樣本的預處理

取血清樣本200 μl置入 1.5 ml離心管中，加入10 μl甲醇，再加入 150 μg/ml的內標物咖啡因儲備液 10 μl，混勻振蕩 10 s，加入甲醇 300 μl，混勻振蕩 1 min，置 15000 r/min高速離心機離心10 min。吸取上清液，抽濾后轉入1.5 ml的離心管中，取20 μl樣品進行色譜分析。

2.5 專屬性考察

按“2.4”項下血清樣本處理方法處理，得空白血清、血清加對照品和內標色譜圖。見圖1。

圖1 空白血清、血清加對照品和內標的高效液相圖譜

由圖1可見，茶堿和咖啡保留時間分別是5.6min和8.1min，兩峰分離完全，峰形良好，內源性物質對測定無干擾，

2.6 線性關系考察

取人空白血清200 μl，置于1.5 ml的離心管中，加入不同濃度的茶堿標準液（0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.40 mg/ml甲醇配制）各 10 μl，得茶堿血藥濃度為 1、2、3、4、5、10、20、40 μg/ml的系列標準血樣。 按“2.4”項下血清樣本的處理過程操作，記錄樣品和內標峰面積。以濃度（X）為橫坐標，茶堿標準溶液峰面積與內標峰面積之比（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果得回歸方程為Y=0.0539X+0.038，r=0.9994（n=8），線性范圍為 1～40 μg/ml。表明茶堿標準品在1～40 μg/ml濃度范圍內與峰面積線性關系良好。見圖2。

圖2 茶堿的標準曲線

2.7 精密度試驗

取空白血清中茶堿濃度為 2、4、20 μg/ml低、中、高溶液同日內測定5次，連續5 d，每天測定1次，計算日內精密度、日間精密度。見表1。

表1 茶堿日內、日間精密度試驗結果（n=5）

2.8 穩定性試驗

取空白血清中茶堿濃度為2、4、20 μg/ml每一濃度進行5個樣本分析，考察茶堿血清樣品經歷冷凍——解凍循環的穩定性。見表2。

表2 茶堿穩定性試驗結果（n=5）

2.9 回收率試驗

取空白血清中茶堿濃度為 2、4、20 μg/ml低、中、高溶液，按按“2.4”項下血清樣本的處理過程操作，同時以流動相代替空白血清，配制2、4、20 μg/ml濃度的茶堿標準溶液。以血清樣品與標準品峰面積比值計算提取回收率，由同步操作制備的標準曲線計算每個血樣的實測濃度，將求得的濃度與已知加入濃度相比，計算血樣茶堿的相對回收率。見表3。

表3 茶堿提取及相對回收率試驗結果（n=5）

2.10 臨床應用

對呼吸科、老年科、ICU連續使用茶堿6 d血藥濃度達穩態時的住院患者（共計36例），于次日早上7：00左右空腹取血行茶堿的血藥物濃度檢測。結果顯示，患者茶堿血藥濃度在 2～26 μg/ml之間。 見表 4。

表4 36例住院患者茶堿血藥濃度的測定結果

3 討論

3.1 茶堿血藥濃度檢測方法的選擇

目前，常用茶堿的測定方法有高效液相色譜法（HPLC）、紫外分光光度法（UV）、熒光偏振免疫分析法（FPIA）、化學發光酶免疫法（CLEIA）。紫外分光光度法測定茶堿的血藥濃度[3-4]在這幾種方法中成本最低，但靈敏度及分辨率差，計算麻煩；熒光偏振免疫分析法和化學發光酶免疫法操作簡單，專屬性高，但熒光偏振免疫分析法需要TDx儀來測定血藥濃度，價格昂貴；化學發光酶免疫法定標有效期短[5-7]。本實驗對茶堿血藥濃度的檢測，首先考慮方法有效性（專一性強、靈敏度好、變異系數低、回收率高），其次是周期短、成本低、樣本處理簡單等因素，故采用高效液相色譜法。

3.2 HPLC法檢測茶堿血藥濃度的條件選擇

3.2.1 流動相的選擇 在HPLC測定茶堿的方法中，目前文獻報道的茶堿測定的流動相選擇主要為醋酸鹽緩沖液-乙腈[8]、甲醇-水[9]、磷酸二氫鉀-乙腈[10]、甲醇-水-醋酸溶液[11]、三乙胺緩沖液-甲醇[12]，筆者對比了流動相甲醇-水和甲醇-水-醋酸鹽緩沖溶液兩者的保留時間和峰面積基本一致，甲醇-水-醋酸鹽緩沖溶液峰形更尖銳，峰高更高。兩者都能對茶堿進行很好的色譜分析，但甲醇-水作為流動相廉價易得，更為經濟，而且比使用含有醋酸緩沖液的流動相更能延長分析柱的壽命，因此本文建議采用甲醇-水為流動相。同時也發現流動相中隨著甲醇比例的提高，茶堿的保留時間明顯縮短，當甲醇比例太高，茶堿組分分離效果不理想。通過預試驗最后確定甲醇-水（25∶75）作為流動相。此比例茶堿的出峰時間亦在5min左右，保留時間均在15 min以內，是主峰出峰時間的3倍。而且被測成分分離效果較好，峰形也良好。

3.2.2 樣本處理方法的選擇 血漿樣品的處理方法有萃取法、蛋白沉淀法等。二氯甲烷-異丙醇[13]、氯仿-異丙醇萃取[14]。萃取法的血樣本干擾少，最低檢測限高。但其操作繁瑣，操作一致性和穩定性較差，同時有機溶劑（如氯仿）對人體傷害大。有文獻報道蛋白沉淀法選用三氯醋酸、高氯酸、甲醇等作為蛋白沉淀劑，前兩者提取回收率較高，但考慮到酸性沉淀劑可能損壞色譜柱，故選用甲醇沉淀蛋白[15]。

3.3 臨床茶堿監測與分析

影響血藥濃度的因素是多方面的，它與藥物劑型、給藥劑量、給藥間隔、給藥方式、患者的生理狀況、病理狀況等是密切相關的。茶堿的藥理作用與血濃度有關，其有效血濃度安全范圍很窄，茶堿濃度維持在5～15 μg/ml可達到較好的療效，超過20 μg/ml即能引起毒性反應[16]。

茶堿血藥濃度監測者中有4例大于20 μg/ml，可能原因：第一，與患者的肝腎功能異常有關，使茶堿的清除率下降，半衰期延長。第二，與其他藥物配伍使用有關，如氟喹諾酮類等可降低茶堿清除率，增加其血藥濃度。第三，與患者高齡生理狀況有關，老年人血漿蛋白減少，會使游離型藥物增多；機體水分減少，脂肪增加，藥物血藥濃度增高，不良反應增加。有9例血藥濃度小于5 μg/ml，一是可能誘導了P450肝藥酶，如酗酒、吸煙等，使其血藥濃度下降。二是與其他藥物配伍使用有關，如鈣拮抗劑以及偏酸性的藥物。三是給藥劑量、間隔不當，正常成年人茶堿的半衰期為（8.7±2.2）h，如1日1次普通片劑或是盡管1日2次普通片劑，但2次間隔很近或是劑量不足，不能達到有效的血藥濃度。這些因素都會影響茶堿在體內的分布、吸收、代謝及排泄，從而影響了患者體內的血藥濃度。盡管影響茶堿的血藥濃度因素有很多，但是依據此方法檢測出的數據，并做適當的調整，使茶堿的給藥劑量更加安全、有效。

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