藥品應急檢驗中如何進行急性毒性試驗研究

肖貴南，陳 琪

廣東省藥品檢驗所，廣東廣州 510180

近年來藥害事件層出不窮，需要通過藥品的應急檢驗進行質量排查，而預先了解藥品的急性毒性情況是十分必要的。在對“齊二藥事件”的處理過程中，首先是進行不同廠家同產品之間的急性毒性測定，得出所懷疑的樣品其毒性遠大于其他廠家同產品的結論，從而啟動進一步的應急處理程序，并取得了較好成效[1]。本文著重介紹了在藥害事件應急檢驗中如何進行藥品的急性毒性試驗（最大耐受量以及半數致死量測定），開展對比試驗，為尋找可能產生整體毒性的質量根源，不斷縮小排查范圍直至找到毒性物質以及藥害事件的快速應對方案提供有益的經驗。

1 最大耐受量的測定

主要考察實驗動物在藥物單次給藥或24 h內多次給藥后的急性毒性情況（不引起動物死亡的最大劑量或濃度）。該方法適合于大多數中藥制劑以及部分毒性極小的化學藥物，難于測出半數致死量（LD50）的情況。應急檢驗就是要比較不同廠家同產品之間的最大耐受量情況，從而得出二者毒性不同的結論。

1.1 測定方法

1.1.1 總的原則

從給藥濃度（灌胃給藥的供試品采用最大溶解度下濃度，注射液采用原液）、給藥體積（一般采用0.4 ml/10 g小鼠，必要時可調整至0.5 ml/10 g小鼠）、給藥次數（參考樣品說明書，一般可接受24 h內給藥3次）三方面進行綜合考慮，一般應取最大值。

1.1.2 預試驗

取健康無孕小白鼠10只，體重18～22 g，雌雄各半，分為兩組，試驗前禁食12 h，不禁水，試驗當天（24 h內）供試品組小鼠灌胃或按規定給藥途徑給予藥液2～3次，給藥后連續觀察3 d，記錄精神狀態等一般情況以及小鼠毒性反應情況，試驗結束后解剖觀察內臟器官有無異常病變。若出現死亡，則可將此劑量作為半數致死量（LD50）的參考劑量之一。

1.1.3 正式試驗

根據上述結果，取健康無孕小白鼠60只，體重18～22 g，雌雄各半。試驗前禁食12 h，不禁水，實驗時按性別、體重將小鼠隨機分為3組，分為樣品組（包括受試樣品及其他廠家同產品各1批）和溶劑對照組。試驗當天（24 h內）參照上述給藥濃度、給藥體積、給藥次數的要求進行給藥，并計算總給藥量，對照組給予等體積溶劑，給藥后記錄小鼠精神狀態等一般情況以及毒性反應情況，由于小鼠若出現死亡一般在給藥后第1～3天，同時考慮到應急檢驗的時效性，觀察并計算3 d后小鼠最大耐受量。

1.2 計算公式

該結果表明，小鼠最大耐受量至少在成人日均用量的計算倍數以上，該數值越大，表明供試藥品的毒性越小[2]。

2 半數致死量的測定

該方法適合于大多數化學藥物以及部分毒性較大的中藥制劑，特別是預試驗出現小鼠死亡的情況。應急檢驗的目的是要比較不同廠家同產品之間的半數致死量大小，從而得出二者毒性不同的結論。

2.1 測定方法

2.1.1 預試驗

取健康無孕小白鼠若干只，體重18～22 g，試驗前禁食12 h，不禁水，實驗時按性別、體重將小鼠隨機分為若干組（供試品各濃度組及純化水對照組），每組2～4只，雌雄各半。預試驗當天供試品各劑量組（2～10倍稀釋）按規定途徑給予小鼠藥液1次，給藥體積為0.4 ml/10 g，對照組小鼠給予等體積溶劑，給藥后連續觀察3 d，記錄精神狀態等一般情況以及小鼠毒性反應和死亡情況，試驗結束后解剖觀察內臟器官有無異常病變。

2.1.2 正式試驗

2.1.2.1 劑量的確定 根據上述預試驗可得出本品小鼠0～100%死亡劑量，考慮到一定的安全系數，正式試驗時可用100%小鼠死亡劑量的1.414倍作為最大劑量，而以0小鼠死亡劑量除以1.414作為最低劑量，在高低劑量之間設置4～6個劑量組，各劑量組的比值一般應相等（一般在0.60～0.85之間）。

2.1.2.2 試驗方法 每一個品種測定時取健康無孕小白鼠60只，體重18～22 g，試驗前禁食12 h，不禁水，按性別、體重將小鼠隨機分為6組（供試品各濃度組及純化水對照組），每組10只，雌雄各半。試驗當天供試品各劑量組按規定途徑給予小鼠藥液1次，給藥體積為0.4 ml/10 g，對照組小鼠灌胃給予等體積溶劑，應急檢驗給藥后連續觀察3 d，記錄精神狀態等一般情況以及小鼠毒性反應和死亡情況。樣品的最高與最低劑量組應分別保證有70%～100%和0～30%的死亡率，這樣可由Bliss法求得新藥小白鼠灌胃給藥的半數致死量LD50及其95%的可信區間，該數值越大，表明供試藥品的毒性越小[3]。

急性毒性試驗的結果可以描述為：采用最大耐受量測定法，測得藥品小白鼠灌胃給藥或注射給藥的最大耐受量為多少；或采用半數致死量測定法（例如Bliss法），測得藥品小白鼠灌胃給藥的半數致死量LD50及其95%的可信區間為多少。

3 討論

近年來藥害事件的頻繁發生，亟需建立相應的應急檢驗研究方法。與常規檢驗不同的是，應急檢驗需要探尋藥品事件發生的質量原因，所需檢驗項目和參考標準也與常規檢驗存在較大差異（可允許應用經過驗證的非標準方法或補充檢驗方法）。由于導致藥害事件的原因復雜多樣，因而應急檢驗除應包括常規檢驗的全部項目外，還應有輔料、微生物指標以及是否添加其他物質、有毒有害物質等探索性檢測的內容。但由于抽樣的可疑藥品數量相對較少，甚至難于符合常規檢驗的最低量，如何對盡量少的可疑樣品進行探索性研究，快速甄別藥品的急性毒性情況，已成為藥品應急檢驗工作者面臨的新課題。

藥害事件除了伴隨患者產生各種不良反應外，出現死亡的個案也不在少數，因而迅速查明樣品的急性毒性情況是十分必要的，在我們所經歷的“清開靈事件”、“香丹事件”、“肝素鈉事件”的應急處理中，急性毒性試驗均發揮了重要的作用。具體來說是堅持循證科學思維，以臨床出現的各臟器急性毒性癥狀為中心，從排查動物整體毒性開始，開展對比試驗，尋找可能產生整體毒性的質量根源，進而還原分析，不斷縮小排查范圍，直至找到最終的毒性物質。

在急性毒性試驗中，根據受試樣品的性質以及預試驗結果確定采用最大耐受量測定還是半數致死量測定。由于該方法具有直觀、靶向性強的特點，在藥害事件的應急處理中往往充當先鋒作用，與一般情況下進行的急性毒性試驗有所不同。由于藥害事件的迅速發生，需要進行快速應對，結合“動物死亡時間多在3 d內”的一般規律，應在給藥后采用觀察動物3 d，且進行不同廠家同產品之間的急性毒性試驗對比，得出所懷疑的樣品其毒性遠大于其他廠家樣品的結論，從而啟動進一步應急處理的程序，為藥害事件的快速處理奠定良好的基礎，實踐證明可取得良好成效[4]。

[1]李瑾翡,梁祈,黎旸.“齊二藥”亮菌甲素注射液毒性物質篩查研究[J].中國藥房,2011,22(5):437-439.

[2]張亞珍,孟文芳,邱麗萍,等.金茵顆粒劑的抗炎作用及最大耐受量的實驗研究[J].齊齊哈爾醫學院學報,2007,28(11):1282-1283.

[3]李寅超,趙宜紅.辛夷揮發油半數致死量(LD50)的測定[J].中國醫院藥學雜志,2009,29(21):1885-1886.

[4]謝志潔,楊德忠,陳勇,等.亮菌甲素注射液應急檢驗排查實踐研究(一)[J].中國藥事,2009,23(3):243-246.