高效液相色譜法測定連梔膠囊中連翹苷和梔子苷含量

許紅輝，張永鋒，趙韶華，柏艷柳，李曉燕

(河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035)

連梔膠囊為我單位自行研發(fā)的中藥六類新藥，由連翹、梔子、甘草等藥味組方。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜法測定了制劑中連翹、梔子的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 2695－2487型高效液相色譜系統(tǒng)。連梔膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號為050101);連翹苷對照品(批號為110821－200507)，梔子苷對照品(批號為110749－200511)均由中國藥品生物制品檢定所提供;乙腈(Fisher色譜純)，其余試劑、試藥均為分析純，水為樂百氏純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Waters Symmetryshield RP18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:測定連翹苷時用乙腈－0.05%磷酸溶液(25∶75)，測定梔子苷時用乙腈－水(13∶87);流速:1 mL/min;檢測波長:測定連翹苷時為205 nm，測定梔子苷時為238 nm;進樣量:20 μL。理論板數(shù)分別按連翹苷峰和梔子苷峰計算均應(yīng)不低于4500。

2.2 溶液制備

精密稱取連翹苷和梔子苷對照品適量，分別加50%甲醇制成每1 mL含2.4 μg和24 μg的溶液，搖勻，即得連翹苷對照品溶液和梔子苷對照品溶液。取本品內(nèi)容物，研細，取0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，上中性氧化鋁柱(100～200目，3 g，內(nèi)徑 1.0 cm)，加水 25 mL 洗脫至 50 mL 的量瓶中，加水至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得連翹苷供試品溶液和梔子苷供試品溶液。

2.3 檢測波長選擇

對連翹苷對照品進行光譜掃描，3個波長的檢測靈敏度相差很大，205 nm波長處最靈敏，約為228 nm波長處的3.7倍，約為277 nm波長處的11.26倍，故選擇205 nm為連翹苷的檢測波長。對梔子苷對照品進行光譜檢測，可見在238 nm波長處有最大吸收，故選擇238 nm為梔子苷的檢測波長。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗:根據(jù)處方配比分別去除連翹、梔子外的其他藥味，按制備工藝、供試品溶液的處理方法分別制成不含連翹或梔子的陰性對照品溶液，精密吸取對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照品溶液各20 μL，進樣，測定。結(jié)果陰性樣品不干擾連翹苷、梔子苷的測定。色譜圖見圖1和圖2。

圖1 連翹苷專屬性試驗高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取不同質(zhì)量濃度的連翹苷對照品溶液或梔子苷對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標、進樣量為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程分別為Y=11359.61X－6075.72(r=0.999998)和 Y=1507.19X －11730.12(r=0.999997)。結(jié)果表明，連翹苷和梔子苷進樣量分別在 2.40 ～192.00 ng和 23.20～1392.00 ng 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:分別精密吸取連翹苷對照品溶液或梔子苷對照品溶液、供試品溶液各20 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)5次測定色譜峰吸收值。結(jié)果對照品溶液、供試品溶液中連翹苷和梔子苷的 RSD分別為0.38%，0.08%和 0.50% ，0.28%。

穩(wěn)定性試驗:分別精密吸取連翹苷對照品溶液或梔子苷對照品溶液、供試品溶液各 20 μL，在 0，2，4，8，16，24 h 時分別進樣，測定色譜峰吸收值。結(jié)果對照品溶液、供試品溶液中連翹苷和梔子苷的 RSD 分別為 0.14%，0.34% 和 0.22%，0.86% ，表明 24 h 內(nèi)連翹苷和梔子苷穩(wěn)定性良好。

重現(xiàn)性試驗:取同批樣品 9 份，分別取樣 0.24，0.30，0.36 g，每個取樣量各制備3份供試品溶液，進樣檢測。結(jié)果樣品中連翹苷的平均含量為0.863 mg/g，RSD為1.36%;梔子苷的平均含量為10.349 mg/g，RSD 為 0.91%。

加樣回收試驗:取同批樣品9份，分為3組，各加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的連翹苷對照品溶液和梔子苷對照品溶液，每個質(zhì)量濃度分別制備3份回收率供試品溶液，依法檢測。結(jié)果見表1。

圖2 梔子苷專屬性試驗高效液相色譜圖

3 討論

測定連翹苷含量時采用了檢測波長205 nm，較2005年版《中國藥典(一部)》[1]中所述的277 nm提高了10余倍的檢測靈敏度。205 nm雖為末端吸收，但經(jīng)試驗可以看出，選取205 nm為檢測波長可提高檢測靈敏性、減少干擾、降低取樣量、延長色譜柱壽命，且含量測定方法學(xué)研究證明方法可行、重現(xiàn)性好。本品中連翹苷、梔子苷含量測定采用同一份供試品溶液，方法簡便易行，降低了檢測成本，節(jié)約能源，且以水為洗脫溶劑，減少了污染，更加低碳環(huán)保。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:117.