西羅莫司膠囊微生物限度檢查方法的建立

鄭小玲，李 玨，張聯(lián)珍，王知堅(jiān)

(1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)所，浙江 杭州 310004; 2.浙江省立同德醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310012)

西羅莫司是一種具有抗真菌活性而無抗細(xì)菌活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物[1－2]。它在臨床的主要作為免疫抑制劑用于防治腎移植排斥反應(yīng)[3]。由于西羅莫司對真菌極為敏感，采用藥典中所推薦的多種常規(guī)微生物限度檢查方法對其進(jìn)行微生物限度檢查存在一定困難，在5種標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證菌株中，白色念珠菌和黑曲霉的回收率無法達(dá)到要求。筆者建立了去除西羅莫司膠囊抑制真菌作用的方法，從而為其微生物限度檢查方法的建立提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

HTY－2000B型集菌儀(杭州高得醫(yī)療器械有限公司);一次性薄膜過濾器(規(guī)格 FC502，孔徑0.45 μm，材質(zhì)混合纖維素，批號為201000208，杭州高得泰林醫(yī)療器械有限公司);GWP－9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);SHP－250型生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。西羅莫司膠囊(某制藥企業(yè)，規(guī)格1 mg)。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號為100406)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號為1001122)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號為100301)均為北京三藥科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)，適用性試驗(yàn)均符合2010年版《中國藥典(二部)》規(guī)定[4]。pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液(批號為091102，杭州華錦藥業(yè)有限公司)。枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌 Escherichia coli[CMCC(F)44102]和白色念珠菌 Candida albicans[CMCC(F)98001]均由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心提供;黑曲霉 Aspergillus niger[CMCC(F)98003]由中國藥品生物制品檢定所提供。吐溫－80(使用濃度為0.1%)[5]。

2 方法[4]與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至對應(yīng)培養(yǎng)基中，分別按規(guī)定時(shí)間和溫度培養(yǎng)。把上述培養(yǎng)物分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 CFU的菌懸液或孢子懸液。

2.2 供試品溶液制備

稱取樣品10 g，加pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，制成1∶10的供試品貯備液。再量取1∶10供試品貯備液10 mL，加pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，制成1∶100的供試品溶液。

2.3 細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查驗(yàn)證試驗(yàn)

細(xì)菌計(jì)數(shù)采用常規(guī)法，取1∶10供試品溶液1 mL，加入1 mL制備好的驗(yàn)證菌菌液，然后每皿加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20 mL，搖勻，37℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。由于西羅莫司不抑制細(xì)菌的生長，采用常規(guī)方法時(shí)，金黃色葡萄球菌的回收率達(dá)到103%，枯草芽孢桿菌的回收率達(dá)到97%，大腸埃希菌的回收率達(dá)到102%。控制菌檢查采用常規(guī)方法，膽鹽乳糖培養(yǎng)基用量為100 mL時(shí)，陽性試驗(yàn)組可檢出大腸埃希菌。故細(xì)菌計(jì)數(shù)及控制菌檢查均可采用常規(guī)法。

2.4 霉菌與酵母菌計(jì)數(shù)檢查驗(yàn)證試驗(yàn)

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)采用薄膜過濾法和增溶劑法聯(lián)用，取1∶100供試品溶液1 mL，加入pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液(含0.1%的吐溫－80，45℃)中至100 mL，混勻。采用薄膜過濾法，將上述供試品溶液全量通過薄膜后，用pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液(含0.1%的吐溫－80，45℃)1000 mL沖洗濾膜(約100 mL/次，沖洗10次)，濾器內(nèi)剩30 mL沖洗液時(shí)，各加入1 mL制備好的驗(yàn)證菌菌液，濾過，取膜貼至玫瑰紅鈉瓊脂平板，25℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

2.5 控制菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)

取1∶10供試品貯備液10 mL，加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 mL和50～100 CFU大腸埃希菌菌液1 mL，37℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。采用不同的方法對西羅莫司膠囊進(jìn)行霉菌和酵母菌檢查的驗(yàn)證試驗(yàn)，回收率結(jié)果見表1。

表1 4種不同方法檢查白色念珠菌和黑曲霉的回收率

3 討論

雖然西羅莫司已在臨床上使用多年，但因其具有極強(qiáng)的抗真菌活性，作為藥物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一的微生物限度檢查方法標(biāo)準(zhǔn)一直未建立，筆者此前也未發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)的研究報(bào)道。在本試驗(yàn)中，筆者對西羅莫司的微生物限度檢查方法進(jìn)行了研究。最初采用培養(yǎng)基稀釋法(1∶5)對西羅莫司膠囊進(jìn)行霉菌及酵母菌的檢查驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果白色念珠菌和黑曲霉的回收率均為零。之后參照2005年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪJ方法[5]，分別嘗試了離心法與培養(yǎng)基稀釋法聯(lián)用(1∶5)和離心法與薄膜過濾法聯(lián)用，且離心后的薄膜過濾法采用藥典所規(guī)定沖洗劑的最大沖洗量1000 mL，但回收率均達(dá)不到要求。且在離心法與薄膜過濾法聯(lián)用中，黑曲霉的回收率達(dá)到了92%，但白色念珠菌的回收率還是為零。由此可見，白色念珠菌對該藥物極為敏感。筆者曾采取了1∶100的供試品溶液，并用pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液1000 mL分次沖洗，結(jié)果白色念珠菌和黑曲霉的回收率均達(dá)不到要求。考慮到西羅莫司微溶于水，采用薄膜過濾法，僅用水溶液作為沖洗劑無法去除抗菌成分，因此筆者最后嘗試薄膜過濾法和增溶劑聯(lián)用的方法，選擇吐溫－80作為增溶劑。首先采用1∶10的供試品溶液進(jìn)行薄膜過濾法，用pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液(含0.1%的吐溫－80，45℃)1000 mL分次沖洗濾膜，該方法中白色念珠菌的回收率僅為27%，且膠囊內(nèi)容物的白色小顆粒影響白色念珠菌的計(jì)數(shù)。根據(jù)2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅩⅨP[4]方法，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，若因沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導(dǎo)致微生物回收的失敗，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級供試品溶液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。故霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)采用1∶100的供試品溶液進(jìn)行試驗(yàn)。筆者發(fā)現(xiàn)，以0.1%吐溫－80為增溶劑，45℃為沖洗溫度，1∶100的供試品溶液稀釋比例可達(dá)到較優(yōu)的試驗(yàn)結(jié)果，白色念珠菌的回收率為103%，黑曲霉的回收率為108%，回收率達(dá)到要求。在試驗(yàn)過程中，沖洗溫度及供試品溶液的稀釋比例需要考慮。沖洗液溫度過低不利于藥物的溶解，過高又會影響藥品中存在的活菌。而供試品溶液的總體積又決定了沖洗是否徹底。此外，吐溫－80作為增溶劑，不僅適用于此前劉鵬等[6]報(bào)道的紅霉素大環(huán)內(nèi)酯類抗生素微生物限度檢查方法中的細(xì)菌計(jì)數(shù)，也適用于西羅莫司膠囊的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)。

[1]Vezina C，Kudelski A，SehgalS N.A new antifungal antibiotic I.Taxonomy of the producing Streptomycete and isolation of the active principle[J].J Antibiot，1975，28(10):721.

[2]Sehgal SN，Baker H，Vezina C.A new antifungal antibiotic Ⅱ.Fermentation，isolation and characterization[J].J Antibiot，1975，28(10):727.

[3]Vignot S，F(xiàn)aivre S，Aguirre D，et al.mTOR－targeted therapy of cancer with rapamycin derivatives[J].Ann Oncol，2005，16(4):525－525.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄107，附錄219.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄 94.

[6]劉 鵬，戴 翚，馬仕洪，等.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素口服制劑微生物限度檢查方法的建立[J].中國抗生素雜志，2009，34(6):352－358.