高效液相色譜法和化學發光酶免疫分析法測定茶堿的血藥濃度

范 毅，劉 夢

(1.江蘇省泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300; 2.南通大學醫學院，江蘇 南通 226000)

茶堿是黃嘌呤類抗支氣管痙攣藥，具有良好的平喘、抗炎作用，幾十年來一直是治療支氣管哮喘等急、慢性肺部疾病的常用藥物，但其治療劑量與中毒劑量較接近，安全范圍較窄，劑量過大或給藥速度太快，易引起嚴重毒性反應甚至死亡，因此檢測茶堿的血藥濃度非常重要。其檢測方法很多，常用的有高效液相色譜法和化學發光酶免疫分析法，兩種方法各有優缺點[1－7]。筆者采用兩種方法對茶堿進行血藥濃度監測，并求出二者的相關性。

1 實驗材料

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜系統(美國Waters公司)，包括2487型雙通道紫外檢測器、1525型二元泵、Empower色譜工作站、80－2型離心機。茶堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為10121－9903);甲醇(TEDIA，色譜純);空白血漿(泰州市中心血站提供)。AXSYM化學發光酶免疫分析儀(美國雅培公司);茶堿試劑盒(TheophllineⅡReagent Pack，美國雅培公司，批號為75267q101)。

1.2 病例資料

2010年3月至2010年5月在我院病房使用氨茶堿治療的患者共40例。其中男29例，女11例;平均年齡69歲。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

精密稱取茶堿對照品適量，置10 mL量瓶中，用甲醇－水(5∶5)溶解，稀釋至刻度，即得10 g/L的茶堿對照品貯備液，置4℃冰箱冷藏備用。取乙丙醇5 mL加入95 mL三氯甲烷中，混勻，即得三氯甲烷－乙丙醇(95∶5)提取液。

2.2 樣品采集與處理

選擇使用茶堿的患者，前臂靜脈取血，達穩態血藥濃度(5～7個半衰期)后，下一次用藥前空腹采血3 mL，2500 r/min離心 5 min，取血清置4℃冷藏，備用。取血清樣品300 μL，置15 mL離心管中，加入提取液3.4 mL，渦旋振蕩2 min，3500 r/min離心10 min，取下清液 0.3 mL，置另 1 只 1.5 mL 離心管中，40 ℃ 吹干，用流動相 100 μL 溶解，渦旋，取 10 μL 進樣。

2.3 高效液相色譜法

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:大連依利特Hypersil BDS C18柱(105 mm×4.6mm，5.0μm);柱溫:25℃;流動相:甲醇－水(5∶5);流速:1 mL/min;檢測波長:273 nm;保留時間:2.8 min;進樣量:10 μL。茶堿的保留時間為 2.8 min，峰形良好，血漿對茶堿的測定無干擾，色譜圖見圖1。

2.3.2 方法學考察

標準曲線繪制:精密稱取茶堿對照品貯備液適量，加空白血漿分別稀釋成5，10，20，40，60，80μg/mL 的血漿標準溶液。取茶堿系列質量濃度的血漿標準液，按2.2項下方法處理后，取10 μL進樣，以峰面積(A)對藥物質量濃度(C)作線性回歸，得標準曲線方程A=16688 C－14173，r=0.9998(n=5)。結果表明，茶堿質量濃度在 5.0 ～80.0μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取空白血漿加入茶堿對照品，配制成10，20，40μg/mL的血漿標準溶液，按2.2項下方法處理血漿樣品后，取10 μL進樣，1 d內重復測定5次，連續測定5 d，計算低、中、高3種質量濃度的日內精密度和日間精密度。結果見表1。

圖1 化學發光酶免疫分析法色譜圖

表1 回收率與精密度測定結果(n=5)

回收率試驗:取配制質量濃度為10，20，40μg/mL的血漿標準溶液，按2.2項下方法處理后，取10 μL進樣，將標準曲線測得的各質量濃度與實際質量濃度比較。結果見表1。可見，平均回收率為102.77%，RSD=2.066%。

穩定性試驗:取低、中、高 3 種質量濃度(10，20，40μg/mL)的茶堿血漿標準溶液各兩份，每份各3 mL，1份室溫放置，1份于－20℃冷凍放置，分別于 0，2，4，8，12 h 時取樣，按 2.2 項下方法操作，進樣10 μL，測定峰面積，考察樣品的穩定性。結果顯示，茶堿血漿樣品在室溫和反復凍融條件下均穩定，測定時不需特殊保護處理。

2.4 化學發光酶免疫分析法

測定原理:采用微粒子固相免疫競爭法，借助化學發光基質產生光子，根據化學發光體系中光子發光強度的大小，測定微量的抗原或抗體。AXSYM分析儀在檢測過程中采用全自動精確加樣系統、恒溫系統、試劑冷藏系統、超聲波清洗系統、磁場分離系統和中心數據處理系統等，能減少實驗誤差，提高檢測速度。

標準曲線繪制:取質量濃度為 0，2.5，5，10，20，40μg/mL 的標準液，加入專用的制備免疫分析儀標準曲線的樣品杯中，放入茶堿試劑盒，運行后儀器自動進行測試和標準曲線擬合。回歸方程為A=－2.7545 C+169.03，r=0.9987(n=6)。

回收率試驗:取質量濃度為5，10，20μg/mL的茶堿標準液，吸取10 μL加入樣品杯中，放入茶堿試劑盒進行測定，每份樣品測定3次，考察方法回收率。由表1結果可見，平均回收率為101.17%，RSD=1.16% 。

2.5 兩種方法測定結果比較

取患者的血樣40例，同一份血樣分別使用高效液相色譜法和化學發光酶免疫分析法測定血藥濃度，所得結果進行相關性濃度分析，以高效液相色譜法測得的質量濃度為 X、化學發光酶免疫分析法測得的質量濃度為Y，得回歸方程 Y=0.9577X+0.4938，r=0.9765。結果表明，兩種方法測得的結果無顯著性差異，見圖2。

圖2 兩種方法相關性

3 討論

本試驗中兩種方法各有優缺點。高效液相色譜法準確、靈敏度高，色譜峰分離比較完全，峰形與重現性都比較好，但耗時較長，適用于要求較高的藥代動力學研究。化學發光酶免疫分析法需要專門的試劑盒，比較昂貴，但可同時大量地對同種藥物的血藥濃度進行監測，節約時間，提高工作效率。

本試驗結果顯示，兩種方法無顯著性差異，相關系數 r=0.9765，表明這兩種方法有較好的相關性，測定結果無需互相校正。

[1]楊愛群，曾 佳，陳 永，等.兩種測定氨茶堿血藥濃度的方法的準確比較[J].解剖學研究，2008，30(1):18－20.

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