固元膠囊多糖的分離純化與初步結構研究

陳衛平，陳琴鳴，劉 斌，戴德雄，劉根才

(1.浙江省麗水市食品藥品檢驗所，浙江 麗水 323000; 2.浙江維康藥業有限公司，浙江 麗水 323000)

固元膠囊是一種免疫調節劑，用于癌癥患者經化學治療或放射治療引起的免疫功能和造血功能障礙，主要由黃芪粗多糖和人參蘆頭組成(黃芪粗多糖∶人參蘆頭為 216.7 g∶55.7 g)，黃芪粗多糖為主藥，且為發揮免疫調節作用的主要成分。固元膠囊質量標準中僅以硫酸－苯酚法測定多糖總量來控制原料和成品的質量，無相對分子質量與分布、單糖組成測定項目，不能有效地控制固元膠囊的質量。筆者對固元膠囊中的多糖組分進行分離純化，得到精制品，并進行了初級結構的初步研究，為進一步提高固元膠囊的質量標準提供依據。

1 儀器和材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);Alltech－2000ES型蒸發光散射檢測器(美國奧泰科技公司);TU－1901型紫外－可見分光光度計(中國普析通用公司);FTIR－8400S型紅外分光度計(日本島津公司)。鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(Glc A)，均購自上?？笊锛夹g有限公司，含量不低于99.0%;氮氣(99%);固元膠囊(浙江維康藥業有限公司，批號為20070202);乙腈、甲醇為色譜純，純凈水，其余試劑為分析純。

2 方法和結果

2.1 固元多糖的提取、精制[1]

將固元膠囊的內容物研細混勻，稱取10 g，加水200 mL微熱使溶解，3500 r/min離心10 min，取上清液，加水200 mL，重復操作，合并上清液，加30% 的H2O2溶液60 mL于50℃水浴保溫3 h，至溶液變為淡黃色半透明溶液后，置水浴中邊攪拌邊緩慢加入等體積10%的三氯醋酸，于冰箱內過夜，3500 r/min離心6 min，取上清液，置旋轉蒸發儀上濃縮至約50 mL，緩緩加入5倍體積的無水乙醇，放置冰箱過夜，經4號砂芯漏斗過濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌3次，真空干燥5 h，得白色的固元多糖精制品粉末。

2.2 純度檢查

紫外分光光度法:取多糖精制品適量，加蒸餾水制成1 g/L的溶液，于200～400 nm波長范圍內進行紫外掃描。結果未發現有核酸(260 nm)及蛋白質(280 nm)的特征吸收峰。

高效分子排阻色譜(HPSEC－ELSD)法:取多糖精制品適量，用水制成1 g/L的溶液，高速離心后用0.45 μm微孔濾膜過濾，取30 μL注入色譜儀，用高效分子排阻色譜法分析。結果可見3個色譜峰，表明其由3部分組成，色譜圖見圖1。

圖1 固元膠囊多糖精制品高效分子排阻色譜圖

2.3 固元多糖各組分的分離

取上述固元多糖精制品，以水為洗脫劑，用Sephadex G 150填充柱洗脫，用高效分子排阻色譜法檢測，收集相同組分。60℃減壓濃縮至小體積，加6倍體積無水乙醇沉淀，沉淀按2.1項下方法洗滌、干燥，得到純品A，而B，C兩組分比例極少，未得到沉淀。固元膠囊多糖A組分的高效分子排阻色譜圖見圖2。

圖2 固元膠囊多糖組分高效分子排阻色譜圖

2.4 固元膠囊多糖A組分的結構分析

理化性狀[2]:固元膠囊多糖A組分為白色粉末，溶于水(尤其是熱水)，而不溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿，水溶液微有乳光，苯酚－硫酸反應呈陽性，比旋度[a]D20=+130°。

相對分子質量及其分布測定:取固元膠囊多糖A組分，用水制成1 g/L的溶液，高速離心后用0.45 μm微孔濾膜過濾，取20 μL注入色譜儀。結果見表1。

單糖組成測定:取固元膠囊多糖A組分，經水解，用色譜柱Prevail Carbohydrate ES柱，流動相CH3CN－H2O(80∶20)，流速 0.8 mL/min，載氣體(N2)流速為2.2 L/min，漂移管溫度為82.5℃，測定單糖。結果A 組分由 Glc A，Rha，Ara，Xyl，Gal，Glc 組成，摩爾比為22.3 ∶0.04 ∶0.08 ∶0.09 ∶1。色譜圖見圖 3。

表1 固元膠囊多糖A組分的相對分子質量測定結果(n=3)

圖3 樣品和對照品混合溶液高效液相色譜圖

紅外光譜分析:取純多糖固元膠囊多糖A組分約20 mg，以KBr壓片，由FTIR－8400 S型紅外分光度計掃描紅外光譜，見圖4。結果在3600～3200 cm－1有寬展圓滑強吸收峰，為糖類－OH伸縮振動;3000～2800(2933)cm－1處吸收峰為糖類 CH3、CH2和CH等的C－H伸縮振動;在1665～1625(1636)cm－1處有一組吸收峰，為糖的水化物的吸收峰;1485－1445 cm－1的吸收峰為CH的彎曲振動;1250～950 cm－1之間的一組峰是兩種C—O的伸縮振動吸收峰;1030 cm－1的吸收峰為吡喃環結構的C—O振動，892 cm－1有極弱的吸收峰說明含少量的β糖苷鍵;833 cm－1有吸收峰，說明是α糖苷鍵;762 cm－1為D－葡萄吡喃糖環對稱環伸縮振動;1650～1550 cm－1處無N－H變角振動的吸收峰，說明無一級和二級氨基;810 cm－1無吸收峰說明無甘露糖。

圖4 固元膠囊多糖A組分的紅外光譜圖

高碘酸氧化及Smith降解[3]:稱取固無膠囊多糖A組分25 mg，用少量水溶解，多糖組分固元膠囊多糖A組分經高碘酸氧化反應，144 h后高碘酸消耗量達最大，平均每摩爾已糖殘基消耗0.61 mol高碘酸，同時無甲酸生成。根據高碘酸氧化原則，以1→2或1→4位鍵合的糖基經高碘酸氧化，平均每個糖基僅消耗1分子高碘酸，且無甲酸釋放;以1→3位鍵合的糖基不被高碘酸氧化;以1→6鍵合的糖基或非還原末端基經高碘酸氧化，消耗2分子高碘酸，同時釋放1分子甲酸;以1→3位鍵合的糖基不被高碘酸氧化。因而可推知，固元膠囊多糖A組分不含或極少含1→6位鍵糖苷，必含1→2或1→4位鍵糖苷。經Smith降解后的薄層色譜檢出甘油和乙二醇，但無赤蘚醇，乙二醇可能為制備過程中帶入，可推知固元膠囊多糖A組分為1→2位糖苷鍵，可能還有少量1→4糖苷鍵。

3 討論

對組分固元膠囊多糖A組分的結構分析表明，其為由Glc A等5個單糖組成的酸性雜多糖，由薄層色譜法與非衍生化高效液相色譜－蒸發光散射檢測法檢測結果基本相同，其相對分子質量用高效分子排阻色譜法測定，結合紅外光譜、高碘酸氧化和Smith降解結果，可推測該組分結構中單糖的連接點類型。結果表明，固元膠囊多糖A組分的比旋度為[a]D20=+130°，重均分子量為1.62 × 106，由 Glc A，Rha，Ara，Xyl，Gal，Glc 組成，物質的量之比為22.3 ∶0.04 ∶0.08 ∶0.09 ∶1，以 α－(1→2)型葡萄糖苷鍵構成糖鏈，可能還有少量β－(1→2)糖苷鍵。

[1]YBZ04242005，國家食品藥品監督管理局標準(試行)[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，2005:附錄 40.

[3]張維杰.糖復合物系列化研究技術[M].第2版.杭州:浙江大學出版社，1999:168.