用權重基因共表達網絡分析識別心臟重構關鍵節點基因

鐘詩龍，伍 虹，楊 敏，劉曉穎，鄭志偉，林秋雄，符永恒，麥麗萍，周志凌，余細勇

(1.廣東省人民醫院醫學研究中心，2.廣東省心血管病研究所，3.廣東省醫學科學院廣東省臨床藥理研究所，廣東廣州 510120，4.中山大學孫逸仙紀念醫院，廣東 廣州 510080)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是引起致殘致死的重要原因。MI后出現以左心室肥大，左心室收縮功能障礙以及左心室纖維化為特征的心臟重構(cardiac ventricular remodeling，VR)，它是發生慢性心力衰竭(CHF)的主要病理基礎，嚴重地影響MI的預后，所以必須積極預防心臟重構，才能提高MI后的生存質量。逆轉左心臟重構是目前心血管疾病治療的重要課題［1］。目前已知MI后，許多因素，包括交感神經和腎素血管緊張素系統(rennin angiotensin system，RAS)的激活、炎性細胞因子的作用、氧化應激及細胞凋亡的發生，都參與了調控心臟重構。其中RAS在心梗后心臟重構中起著重要的作用，而血管緊張素轉換酶1(ACE1)和ACE2平衡在CHF的發病機制及其治療中具有極其重要作用［1］，然而它們的上游調控機制還不清楚。

本研究擬采用權重基因共表達網絡分析方法(WGCNA)挖掘從NCBI的GEO下載2個心肌梗死后心臟重構的全基因組表達數據，研究心肌梗死后心臟重構的權重基因共表達網絡關系，識別心臟重構的相關模塊及其關鍵調控基因，闡明這些模塊在心肌梗死后心臟重構中相對重要性及其網絡關系;并研究關鍵調控基因與ACE1和ACE2的關聯性，為ACE1和ACE2的上游調控機制提供研究基礎，為心臟重構治療提供靶點。

權重基因共表達網絡分析是一種新開發的強大的用于解析分子作用機制和網絡關系的系統生物學方法［2］。權重基因共表達網絡分析方法自誕生以來被成功應用于多種生物環境，并取得了許多重要發現［3－6］。這一新的研究方法為我們揭示心臟重構的分子機制提供了銳利的武器。

1 方法

1.1 GEO全基因組表達數據 從NCBI的GEO下載2個心肌梗死后心臟重構的全基因組表達數據GSE7487［7］和 GSE738［8］。GSE7487 發表于 2010 年3月，在設計上，3－4月的小鼠通過結扎左前降支造成心肌梗死模型制備心肌重構模型，對照為假手術模型，飼養8周后處死收集左室心肌組織，提取mR-NA，用Affymetrix Mouse Genome 430 2.0芯片檢測全基因組基因表達。GSE738發表于2004年3月，在設計上，大鼠通過結扎左前降支造成心肌梗死模型制備心肌重構模型，對照為假手術模型，飼養3～9周后處死收集無梗死斑的左室心肌組織(本研究只取9周時的數據)，提取mRNA，用Affymetrix大鼠RGU34A芯片檢測全基因組基因表達。

1.2 心肌梗死后心臟重構的WGCNA及關鍵調控基因識別 WGCNA是一個系統生物學分析方法，主要途徑如下。①基因表達數據初處理:對基因表達數據作背景校正和標準化后，濾過異常和變異小的基因，濾過標準如下:平均表達量與中位數表達量比值＞5的基因;至少有一個表達量＞30 000的基因;平均表達量排在50%以后及表達變異排在50%以后的基因。②構建共表達網絡:我們用基因共表達相似性來定義網絡。如果用sij來表示一對基因i和j的基因共表達相似性，那么我們可以用冪鄰接函數的方法把相關性轉化基因的鄰接關系:(Sij)signed=(1+cor(xi，xj))/2。在數據處理時，先對全基因組基因表達數據作初步濾過，然后用Pearson相關性測量基因表達譜的一致性，最后用冪鄰接函數的方法把Pearson相關矩陣轉化成權重共表達網絡。③網絡模塊(Module)分析:網絡模塊是指相互緊密關聯的基因的組合。在模塊檢測時，首先將上述鄰接行列矩陣(它是拓撲結構相似性的度量)轉化成拓撲結構的不相似性，再用聚類分析檢測模塊。然后用t檢驗分析基因重要性來確定模塊是否與心臟重構有關聯。④模塊向量基因(Eigengene):模塊向量基因指模塊表達矩陣的第一主成分基因。它被認為模塊中最具代表性的基因，因而有重要生物學意義。模塊向量基因可以通過對表達數據的奇異值分解得到(X=UDVT)，X是指定模塊的基因表達數據，V1表示模塊向量基因。向量基因網絡是一個非常有效的研究系統生物學的工具。⑤模塊聯盟(module membership，MM)分析和關鍵調控基因(hub genes)識別:通過計算基因i與模塊內的向量基因的關聯得到模塊聯盟:MM(i)=|cor(x(i)，ME)|。我們主要考慮MM值，然后考慮基因重要性確定關鍵調控基因。⑥特異信號轉導通路分析與可視化:用VisAnt程序分別對重要模塊的基因作信號轉導通路分析和可視化分析。⑦ 采用DAVID功能注釋生物信息學芯片分析系統對與心臟重構相關的網絡模塊基因進行基因富集分析。

1.3 關鍵調控基因與ACE1和ACE2的關聯性分析 Student’s T檢驗分析關鍵調控基因、ACE1和ACE2在心臟重構與假手術組之間的差異。用線性回歸分析關鍵調控基因RCAN1與ACE1和ACE2的關聯性。

1.4 驗證大鼠心肌梗死模型的建立 按本課題組發表的方法建立急性心肌梗死后心臟重構大鼠模型［9］。假結扎組大鼠操作步驟同上，開胸過線只留線不結扎。模型大鼠和對照大鼠飼養6周后分析心臟重構的指標，處死收集左室心肌組織、觀察心臟形態改變并作病理學分析。

1.5 RT-qPCR檢測基因表達 從梗死模組大鼠心肌梗死區和假手術組大鼠相應心肌區域提取RNA，用RT-qPCR檢測RCAN1與ACE1和ACE2基因表達。用Student's T檢驗分析關鍵調控基因、ACE1和ACE2在心臟重構與假手術組之間的差異。用線性回歸分析關鍵調控基因RCAN1與ACE1和ACE2的關聯性。

2 結果

2.1 GE O全基因組表達數據基本信息 在GSE7487全基因組表達數據中，模型組與對照組各包括12個數據。原始數據用MAS5作基因表達數據作背景校正和標準化，下載數據包括45 037個基因探針。在本研究中，每個探針看作一個基因。在構建基因共表達模塊與網絡時，為了減輕噪音和減輕計算機的運算負擔，需對數據作初處理，首先濾過變異小的基因、異常數據，然后濾過與其他基因相關性小的基因，最后保留6 846個基因。

在GSE738全基因組表達數據中，模型組與對照組各包括6個數據。Affymetrix大鼠RGU34A芯片包括8 740個基因(包括59個質控基因，在分析中去除)。數據作初處理按照上述數據處理方法。

2.2 心肌梗死后心臟重構的權重基因共表達網絡模塊 用GSE7487全基因組表達數據分析結果顯示小鼠心肌梗死后心臟重構有17個網絡模塊。這些模塊是通過用基于拓撲結構重疊的不相似性的聚類方法分析來檢測到，如圖1A所示，每一個模塊用一種顏色來表示。用GSE738全基因組表達數據分析結果顯示大鼠心肌梗死后心臟重構也有17個網絡模塊，如Fig 1B所示。

在17個小鼠心肌梗死后心臟重構的網絡模塊中有6個模塊與心臟重構相關，見Fig 1C。在17個大鼠心肌梗死后心臟重構的網絡模塊中有5個模塊與心臟重構相關，見Fig 1D。

2.3 DAVID信號通路富集分析 用DAVID功能注釋生物信息學芯片分析系統進一步對與小鼠心肌梗死后心臟重構相關的6個模塊進行KEGG信號通路富集分析，發現模塊基因富集于16條KEGG信號通路。對與大鼠心肌梗死后心臟重構相關的5個模塊進行KEGG信號通路富集分析，模塊基因富集于15條KEGG信號通路，其中有10條信號通路與第1組數據結果相同，這些信號通路涉及心肌肥厚病理、氧化磷酸化、代謝等。結果見Tab 1。兩組數據結果的高度一致顯示WGCNA方法的健壯性和準確性。

Fig 1 Network module identification and gene significance analysis of cardiac remodeling after myocardial infarction by WGCNA

2.4 心臟重構的關鍵調控基因 通過比較模塊內連通性和基因重要性可以幫助找到一些心臟重構的關鍵調控基因。在模塊中與其他基因關聯性越多的基因，往往在模塊中的作用越重要，如Fig 2A顯示黑色模塊中在右上角的基因既與其他基因相關性大、又對心臟重構的重要性大。特別關注模塊內連通性最大的30個基因，用VisAnt程序分別對重要模塊的基因作信號轉導通路分析和可視化分析顯示鈣依賴磷酸酶調節子(RCAN1)是心臟重構的一個關鍵調控基因。信號轉導通路可視化見Fig 2B。

2.5 關鍵調控基因RCAN1與ACE1和ACE2的關聯性分析 因為ACE1在慢性心力衰竭的發病機制及其治療中有極其重要作用，因此我們對關鍵調控基因RCAN1與ACE1和ACE2的關聯性進行分析。Student's T檢驗分析表明關鍵調控基因RCAN1與ACE1在心臟重構中表達升高，而ACE2在心臟重構與假手術組之間無差異。線性回歸分析表明RCAN1表達與ACE1表達高度相關。在動物模型中驗證結果與上述結果一致，ACE1在心臟重構中表達增加，并與RCAN1表達呈正相關(r=0.749，P＜0.001);而 ACE2表達基本沒改變，與RCAN1表達無關聯(r=0.144，P=0.532)。

3 討論

在本研究中，通過權重基因共表達網絡分析方法分別對2個心肌梗死后心臟重構的全基因組表達數據進行分析，成功識別心肌梗死后心臟重構的網絡模塊，小鼠與大鼠的心臟重構的信號通路基本相似，這些信號通路涉及心肌肥厚病理、氧化磷酸化、代謝等。值得注意的是幾條與神經系統有關的信號通路明顯富集，如帕金森癥、阿爾采末癥、亨廷頓舞蹈癥相關通路，這提示心肌重構與神經重構有一定關聯。

進一步利用模塊內連通性和基因重要性找到了一些心臟重構的關鍵調控基因，如鈣依賴磷酸酶調節子(RCAN1)。RCAN1表達與ACE1表達在心臟重構中均表達增加，且高度相關，而ACE2表達基本沒改變。這種相關性在我們建立的大鼠心肌梗死模型中得到驗證。由此可見心臟重構中RAS系統中的ACE1－ACE2已經失去平衡，這可能是心臟重構的一個重要機制。為了彌補失去平衡的ACE1－ACE2系統，提高ACE2的活性也許是治療心衰的一個重要手段。最近研究發現，ACE2表達增加可以減輕大鼠心梗模型心肌重構和心功能失調［10］。RCAN1作為心臟重構的關鍵調控基因可能是ACE1的上游調控機制，但這需要進一步研究驗證。

Fig 2 Relationship of module membership with gene significance(A)and pathway visualization of 30 genes with the highest module membership.

Tab 1 Gene enrichment analysis of KEGG pathway

［1］ Oudit G Y，Penninger J M.Recombinant human angiotensin-converting enzyme 2 as a new Renin-Angiotensin system peptidase for heart failure therapy［J］.Curr Heart Fail Rep，2011，8(3):176 －83.

［2］ Langfelder P，Horvath S.WGCNA:an R package for weighted correlation network analysis［J］.BMC Bioinformatics，2008，9:559.

［3］ Mason M J，Fan G，Plath K，et al.Signed weighted gene co-expression network analysis of transcriptional regulation in murine embryonic stem cells［J］.BMC Genomics，2009，10:327.

［4］ Oldham M C，Konopka G，Iwamoto K，et al.Functional organization of the transcriptome in human brain［J］.Nat Neurosci，2008，11(11):1271－82.

［5］ Liao Q，Liu C，Yuan X，et al.Large-scale prediction of long noncoding RNA functions in a coding-non-coding gene co-expression network［J］.Nucleic Acids Res，2011，39(9):3864 － 78.

［6］ Plaisier C L，Horvath S，Huertas-Vazquez A，et al.A systems genetics approach implicates USF1，FADS3，and other causal candidate genes for familial combined hyperlipidemia［J］.PLoS Genet，2009，5(9):e1000642.

［7］ Lin R C，Weeks K L，Gao X M，et al.PI3K(p110 alpha)protects against myocardial infarction-induced heart failure:identification of PI3K-regulated miRNA and mRNA［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30(4):724 －32.

［8］ Strom C C，Kruhoffer M，Knudsen S，et al.Identification of a core set of genes that signifies pathways underlying cardiac hypertrophy［J］.Comp Funct Genomics，2004，5(6-7):459 －70.

［9］ Fu Y H，Lin Q X，Li X H，et al.A novel rat model of chronic heart failure following myocardial infarction［J］.Methods Find Exp Clin Pharmacol，2009，31(6):367 －73.

［10］ Zhao Y X，Yin H Q，Yu Q T，et al.ACE2 overexpression ameliorates left ventricular remodeling and dysfunction in a rat model of myocardial infarction［J］.Hum Gene Ther，2010，21(11):1545 －54.