側腦室注射八肽膽囊收縮素及其受體拮抗劑對嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響

文 迪，馬春玲，叢 斌，張雅靜，2，楊勝昌，孟雁欣，于 峰，倪志宇，李淑瑾

(1.河北醫科大學基礎醫學院法醫學系，河北省法醫學重點實驗室，河北石家莊 050017;2.石家莊市第一醫院，河北石家莊 050011)

長期反復使用外源性阿片類藥物，打破了內源性阿片肽系統的平衡，復雜的神經、內分泌網絡變化過程中存在多種生物活性物質的分泌和變化，以適應進入體內的大量阿片類物質;一旦停止用藥，可引起機體機能功能紊亂，出現一系列的戒斷癥狀。八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)是迄今體內最強的抗阿片肽類物質［1］，參與調節疼痛、焦慮情緒、記憶和認知等過程［2］。外源性和內源性阿片物質均可促進中樞CCK基因的表達和生物合成以及CCK-8的釋放;我室以往的研究發現，嗎啡可使大鼠原代培養海馬神經元上CCK1及CCK2受體 mRNA表達上調，并以 CCK2受體為主［3－4］，說明CCK在阿片成癮過程中也發揮著重要作用。本研究旨在觀察CCK-8及CCK受體拮抗劑對嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響，并檢測CCK-8對大鼠腦組織 μ阿片受體結合活性的影響，探討CCK-8在嗎啡依賴過程中的作用及其相關受體機制，為CCK-8在戒毒方面的應用提供相關實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 成年♂Wistar大鼠60只，體質量(200±10)g，由河北省實驗動物中心提供(實驗動物質量合格證:901014)。鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠);鹽酸納洛酮、CCK-8、DAMGO(美國 Sigma公司);devazepide、LY-288，513(英國 Tocris公司);［3H］-DAMGO(放射比活度 2.1 × 1015Bq·mol－1，濃度3.7 ×1010Bq·L－1，美國 PE 公司)，GF-B 型玻璃纖維濾膜(英國Whatman公司)。Angel Two腦立體定位儀(美國MyNeurolab公司);微量注射泵(美國KdScientific公司);微量注射套管(深圳瑞沃德生命科技有限公司);LS-6500型液體閃爍計數儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 動物模型的建立及分組 參照文獻［5］建立大鼠慢性嗎啡依賴及急性催促戒斷模型:以劑量遞增法連續皮下注射嗎啡(10、20、30、40、50 mg·kg－1)5 d，每天2 次，間隔12 h(8:00、20:00)。d 6 8:00 皮下注射嗎啡50 mg·kg－1，2 h后腹腔注射鹽酸納絡酮(5 mg·kg－1)進行催促戒斷，記錄戒斷后大鼠軀體戒斷癥狀，包括戒斷后15 min內跳躍次數、齒顫、濕狗樣抖動、腹瀉、血淚、流涎、激惹及1 h后體重變化，用改良 Gellert-Holtzman法［6］進行戒斷癥狀的評價，具體評價方法見Tab 1。大鼠隨機分組如下:①鹽水對照組(Control):背部皮下注射同等劑量的生理鹽水;②嗎啡依賴組(Mor):按照上述方案進行嗎啡皮下注射;③納洛酮催促戒斷組(Mor-Nal):按照上述方案給予嗎啡皮下注射后2 h進行納洛酮催促戒斷;④慢性藥物干預組(CCK-8，Dev，LY-288，513-Mor-Nal):給予嗎啡前 10 min側腦室注射 CCK-8(0.1 μg)，devazepide(1 μg)，LY-288，513(1 μg)，余同③;⑤溶劑對照組(Veh-Mor-Nal):給予嗎啡前10 min，注射同等體積的溶劑(DMSO∶1，3-丙二醇=1∶4，2 μl)，余同③。

Tab 1 Gellert-Holtzman scale

1.3 大鼠腦立體定位及腦室注射 戊巴比妥鈉40 mg·kg－1腹腔注射麻醉大鼠，取顱骨正中切口，10%H2O2進行燒灼，充分暴露顱骨表面前囟、人字縫等表面標志。核團定位以前囟為參照零點，用牙科鉆打孔后通過立體定位儀的操作桿將微量注射套管 (外徑0.6 mm，內徑0.4 mm)插入腦內(AP，－1.67;ML，±0.92;DV，－3.10)用于腦室內給藥，并用502膠及牙科水泥將微量注射套管固定于顱骨表面，術后預防性給予抗生素3 d。注射時將套管針芯拔出，插入內注射管，連接PE管和微量注射器進行注射。術后大鼠單籠飼養7 d后開始實驗，側腦室注射體積 2 μl，注射速度 0.5 μl·min－1，注射完后留針 5 min。實驗完畢后通過套管注射 2 μl 0.1%臺盼藍，取腦觀察腦室是否藍染，剔除定位不準確的動物，最后保證每組6只動物。

1.4 大鼠腦組織膜受體蛋白的制備 大鼠斷頭取腦，加入10倍體積預冷的組織裂解液(50 mmol·L－1Tris-Cl pH 7.4，0.32 mol·L－1蔗糖，5 mg·L－1Aprotinin，5 mg· L－1Leupeptin，1 mmol· L－1PMSF，5 mmol·L－1EDTA)，冰浴下高速勻漿 1 min。冰浴孵育30 min，并用1 ml注射器反復抽吸5～6次，使其充分裂解。低速離心 10 min(4℃，1 000×g)，取上清超速離心20 min(4℃，20 000×g)，沉淀用 Tris-Cl緩沖液(50 mmol·L－1，pH 7.4)充分懸浮后，再次超速離心20 min(4℃，20 000×g)后將沉淀懸浮備用。考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(微板法)測定蛋白濃度后，用Tris-Cl緩沖液調整濃度至 1 g·L－1。

1.5 放射配基結合反應 總結合管中加入100 μl Tris-Cl緩沖液、100 μl膜蛋白制備液、100 μl［3H］－DAMGO(0.5 ～8 nmol·L－1);非特異結合管中加入 50 μl Tris-Cl緩沖液、100 μl膜蛋白制備液、50 μl DAMGO(5 μmol·L－1)、100 μl［3H］-DAMGO，總體積為300 μl，均做3個平行復管。充分混勻后4℃孵育過夜，次日在冰水浴中靜置3 min終止反應，迅速通過玻璃纖維濾膜負壓抽濾，分離未結合的標記配基，并用4 ml預冷的Tris-Cl緩沖液沖洗濾膜。取出濾膜經80℃ 40 min烤干，置于裝有2 ml閃爍液(PPO 0.3 g，POPOP 3 g，二甲苯1 L)的 EP管中靜置過夜，將 EP管放入閃爍杯中用 Beckman LS-6500型液體閃爍計數儀測量放射性活度(count perminute，CPM)。特異結合(specific binding，SB)為總結合(total binding，TB)與非特異結合(non-specific binding，NSB)之差。

1.6 統計學處理 ［3H］-DAMGO與μ阿片受體結合的平衡解離常數(Kd)和最大結合容量(Bmax)由GraphPad software進行分析，用Scatchard作圖法經直線回歸方程求得。所得數據用SPSS11.0進行統計學分析，以±s表示，各組均數的比較行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較。戒斷癥狀評價中觀察癥狀(Checked signs)以組內出現癥狀動物的百分數表示，組間差異采用Exact Logistic回歸模型進行比較。

2 結果

2.1 CCK-8及其受體拮抗劑對嗎啡成癮大鼠戒斷癥狀的影響 嗎啡依賴大鼠在給予納絡酮催促戒斷后，觀察到齒顫、濕狗樣抖動、腹瀉、血淚、流涎、激惹、跳躍、體重明顯下降等戒斷癥狀，戒斷組Gellert-Holtzman評分為(37.6±4.1)，與對照組(3.9 ±0.6)相比差異有顯著性(P＜0.01)。在嗎啡注射前10 min側腦室注射CCK1受體拮抗劑Devazepide和CCK2受體拮抗劑LY-288，513慢性干預均能降低嗎啡成癮大鼠的戒斷癥狀評分，其Gellert-Holtzman評分分別為(26.2±3.3)、(14.8±2.7)，與戒斷組相比差異均有顯著性(P＜0.01)，且 LY-288，513的作用優于Devazepide(P＜0.01);給予外源性 CCK-8(CCK受體激動劑)慢性干預同樣可減輕嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀，其評分為(15.6±0.7)，與 CCK受體拮抗劑的作用一致(Fig 1)。CCK-8及其受體拮抗劑均可不同程度地改善體重下降(Fig 2)、跳躍、齒顫、流涎等戒斷癥狀(Tab 2)。

Tab 2 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on checked signs of morphine withdrawal(±s，n=6)

Tab 2 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on checked signs of morphine withdrawal(±s，n=6)

Each of the listed signs was checked if present at any point during the 15 min observation session.The data was then converted to the percentage of rats in a particular experimental group which displayed that sign during the observation period.▲P ＜0.05 vs control;*P ＜0.05 vs Mor-Nal group.

Withdrawal Sign Control Mor Mor-NalCCK-8 Dev LY-288，513 Veh Diarrhea 0 0 1.0▲0.67 0.33 1.0 0.67 0.83 0.67 1.0 Teeth chattering 0 0 1.0▲ 0.67 0.63 0.33* 0.83 Ptosis 0 0 0.83▲ 0.33 0.67 0.17* 1.0 Chromodacryorrhea 0 0 0.67▲ 0.17 0.33 0.33 0.83 Abnormal posture0.17 0.17 1.0▲ 0.67 0.67 0.67 1.0 Genital grooming 0 0 0.83▲ 0* 0.33 0.17* 0.83 Irritability 0 0.17 1.0▲ 0.33*

Fig 1 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on the Gellert-Holtzman score of the overall withdrawal severity(±s，n=6)

2.2 CCK-8對大鼠腦組織μ阿片受體結合反應的影響 選取膜蛋白100 μg、［3H］-DAMGO 2 nmol·L－1、非標記配基 DAMGO 濃度 10 nmol·L－1作為結合反應的條件，在反應體系內加入不同濃度(10－8～10－5mol·L－1)的CCK-8進行競爭結合抑制實驗，發現10－8～10－5mol·L－1CCK-8 可以劑量依賴性地抑制大鼠腦組織中μ阿片受體與配基的結合(P＜0.01，Fig 3)，并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受體拮抗劑翻轉(P＜0.01，Fig 4);我們進一步用膜蛋白 100 μg、［3H］-DAMGO 0.5 ～8 nmol·L－15 個濃度點、非標記配基 DAMGO濃度10 nmol·L－1、4℃孵育過夜作為放射配基結合分析的條件(Fig 5)，測定了不同濃度的 CCK-8(10－10～ 10－6mol·L－1)對大鼠腦組織μ阿片受體的結合反應的Bmax和Kd值的影響，發現 CCK-8(10－8～10－6mol·L－1)可劑量依賴性的降低 μ阿片受體結合反應的Bmax值(P ＜0.01，Fig 6)，而對 Kd值無影響(P ＞0.05，Fig 7)。

Fig 2 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on the percentage of the weight loss(±s，n=6)

Fig 3 Effect of 10-8～10-5mol·L-1CCK-8 on binding of［3H］-DAMGO to μ-opioid receptor(±s，n=3)

Fig 4 Inhibitory effect of CCK-8(10-6mol·L-1)on binding of［3H］-DAMGO to μ-opioid receptor is blocked by CCK1 receptor antagonist devazepide and CCK2 receptor antagonist LY-288，513(±s，n=3)

Fig 5 Effect of CCK-8(10-6mol·L-1)on saturation curve of μopioid receptor binding assay.

Fig 6 Effect of 10-10 ～ 10-6mol·L-1CCK-8 on Bmaxof μ-opioid receptor(±s，n=3)

Fig 7 Effect of 10-10 ～ 10-6mol·L-1CCK-8 on Kdof μ-opioid receptor(±s，n=3)

3 討論

CCK-8是目前已知作用最強的內源性“抗阿片肽”，并作為一種神經遞質/調制在中樞系統發揮著重要作用。本室以往研究發現給予嗎啡前外周腹腔注射CCK-8及CCK受體拮抗劑均可減輕慢性嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀，并可通過調節阿片受體［7］及其受體后Ca2+-CaM-CaMKⅡ信號通路發揮作用［8］，但是由于CCK-8不能通過血腦屏障，其外周和中樞機制可能并不一致，CCK-8的相關作用機制也不明確，所以本研究通過側腦室中樞給藥的方式進一步觀察了CCK-8及CCK受體拮抗劑對慢性嗎啡依賴大鼠的影響;并采用放射配基結合實驗，在體外觀察CCK-8對μ阿片受體結合反應的影響。結果顯示，每次注射嗎啡前10 min側腦室給予CCK-8及CCK受體拮抗劑進行慢性干預，均可不同程度的減輕慢性嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀，可明顯緩解體重下降、腹瀉、跳躍、齒顫、流涎等癥狀。阿片受體是外源性阿片類物質直接作用的靶點，在阿片類物質濫用后造成一系列后效應，使機體多個系統發生功能紊亂。放射配基結合實驗結果顯示，CCK-8可以抑制μ阿片受體與其配基的結合，并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受體拮抗劑翻轉;CCK-8劑量依賴性的降低了μ阿片受體結合反應的Bmax值(受體結合容量)，而對 Kd值(受體親和力)無影響;說明CCK-8并非直接影響 μ阿片受體的結合，而是與CCK受體結合后，繼而與 μ阿片受體形成復合體，占據μ阿片受體的結合位點，降低受體結合容量，發揮其“抗阿片”效應，CCK系統與阿片系統可通過受體水平的對話(cross talk)發生相互作用。

內源性CCK對抗阿片物質的作用可能是導致阿片類物質耐受和成癮的機制之一，CCK可從受體及受體后水平拮抗阿片系統的功能，還可調節多巴胺能神經元的活動，并參與多巴胺調節的可卡因自身給藥模型、嗎啡條件位置性偏愛的表達、焦慮情緒等過程［11－12］，在成癮藥物引起的獎賞效應中具有重要作用。因此，應用CCK受體拮抗劑能逆轉嗎啡耐受［9］、減輕嗎啡催促戒斷癥狀［10］。CCK-8 與 CCK1及CCK2受體均有較強的親和力，本研究發現外源性CCK-8慢性干預也可一定程度的減輕戒斷癥狀，與CCK受體拮抗劑的作用一致。我們考慮:CCK-8作用的量效關系成“U”型曲線，所以外源性大劑量CCK-8與內源性CCK的作用可能相反;我們也證實了大劑量CCK-8本身反而使內源性阿片肽水平增加，并可改善嗎啡依賴后內源性阿片系統的紊亂［13］。另外，外源性CCK干預與內源性 CCK的分泌時相不一致，所以不同的給藥方式及時間也可能造成實驗結果的差異，注射嗎啡前給予CCK-8干預，可能拮抗了嗎啡的作用，發揮其“抗阿片”作用，進而影響外源性阿片物質引起的腦功能紊亂，減輕戒斷癥狀。但是，阿片成癮涉及受體、神經遞質、細胞分子水平的調節等環節，是一種復雜的腦功能紊亂;在阿片成癮的不同過程中，其神經機制并不一致，CCK-8在成癮各個環節的作用可能并不相同，在不同的實驗研究模型中也表現出不同的結果，外源性CCK-8對嗎啡成癮不同階段的作用及其相關機制還有待進一步明確。

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