細胞因子信號傳導抑制蛋白1對腫瘤壞死因子-α誘導的腎小管細胞凋亡的影響

杜春陽，史永紅，崔立文，任韞卓，王月華，趙 松，段惠軍

(河北醫(yī)科大學1.病理學教研室、2.第四醫(yī)院，河北 石家莊 050017)

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由157個氨基酸構成的生物學活性多樣的多肽類物質(zhì)，具有免疫及炎癥雙重功能，參與細胞的分化、增殖及凋亡［1］。以往研究表明，TNF-α能夠通過激活JNK及NF-κB兩條細胞信號傳導通路參與了包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程［2］。TNF-α可以通過激活腫瘤壞死因子I型受體(TNFR1)誘導腎小管上皮細胞炎癥反應及凋亡［3］。JAK/STAT信號通路是體內(nèi)一條重要的信號轉(zhuǎn)導通路，可以被包括TNF-α在內(nèi)的多種細胞因子激活［4］。細胞因子信號傳導抑制蛋白(suppressors of cytokine signaling，SOCS)家族是JAK/STAT信號通路重要的負調(diào)控因子［5］。我們最近的研究顯示SOCS-1過表達能夠抑制AGEs誘導的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化［6］。目前，有關SOCS家族對TNF-α誘導腎小管上皮細胞 JAK/STAT信號通路活化及其細胞凋亡作用的研究還未見報道。本實驗旨在觀察SOCS-1基因轉(zhuǎn)染對TNF-α誘導的腎小管上皮細胞凋亡和JAK/STAT信號通路活化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 pCR3.1/SOCS-1表達載體由德國慕尼黑大學Christoph J.Auernhammer教授惠贈。HKC細胞由解放軍總醫(yī)院腎內(nèi)科陳香美教授惠贈。D-葡萄糖、AG490和rhTNF-α為Sigma公司產(chǎn)品。小鼠抗p-STAT1單克隆抗體(A-2)，小鼠抗Bax單克隆抗體(P-19)，兔抗 SOCS-1、p-JAK2、JAK2、STAT1、Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體和ECL增強化學發(fā)光試劑盒為Santa Cruz公司產(chǎn)品。Cleaved caspase-3為美國Cell Signaling公司產(chǎn)品。脂質(zhì)體2000和pCR3.1質(zhì)粒載體購自Invitrogen公司。TUNEL試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品。辣根酶標記羊抗小鼠或兔IgG購自北京中杉金橋公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)為美國Milipore公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組刺激實驗 HKC細胞在低糖型DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分數(shù)0.1胎牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素)中常規(guī)培養(yǎng)。將HKC細胞分為5組:正常對照組(N)、TNF-α 組(T)、SOCS-1 轉(zhuǎn)染 +TNF-α 組(pCR3.1/SOCS-1，S1+T)、空質(zhì)粒載體對照組(pCR3.1，V+T)和 AG490干預組(AG490+T)。采用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染pCR3.1/SOCS-1和pCR3.1質(zhì)粒載體。采用G418(0.5 g·L-1)篩選陽性克隆。將篩選出的陽性克隆細胞進行傳代培養(yǎng)。待細胞達60% ～80%融合后用無血清培養(yǎng)基同步12 h。然后采用 TNF-α(20 μg·L-1)進行刺激。12 h收集細胞，進行以下觀察。

1.2.2 流式細胞術(FCM)檢測 收集上清中細胞及貼壁細胞，PBS洗兩次，采用體積分數(shù)為0.70的冷乙醇4℃固定24 h，PBS洗兩次，碘化丙啶4℃避光染色30 min，流式細胞儀分析。

1.2.3 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導dUTP缺口標記法(TUNEL)檢測 細胞接種于8孔Leb-Tak腔室玻片(美國Nalge Nunc公司)上，進行分組刺激。具體步驟嚴格按試劑盒使用說明書進行。細胞核呈棕黃色者為陽性細胞，每孔至少計數(shù)500個細胞，計算陽性細胞百分比。

1.2.4 Western blot檢測 細胞用冰冷PBS洗2遍，加入細胞裂解液(25 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1EDTA，體積分數(shù) 0.01 NP-40，150 mmol·L-1氯化鈉，質(zhì)量濃度1 g·L-1苯甲基磺酰氟)，冰浴1 h，4℃、14 000 r·min-1離心25 min，Lowry 法測定上清液蛋白濃度。取細胞裂解蛋白50 μg，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;質(zhì)量分數(shù)為0.05脫脂奶粉封閉 PVDF 膜 2 h，分別加入 p-JAK2、p-STAT1、Bax、Bcl-2、SOCS-1、JAK2、STAT1、Caspase-3 及 Cleaved caspase-3抗體，4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔抗體(1∶5 000稀釋)，37℃孵育1.5 h;洗膜后加ECL試劑，然后將PVDF膜放入X線片暗盒，壓片，顯影，定影。用美國UVP公司LabWorks 4.5分析系統(tǒng)軟件對Western blot條帶進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 SOCS-1對TNF-α誘導HKC細胞凋亡的影響 Western blot結(jié)果顯示，與其他3組相比，SOCS-1蛋白在pCR3.1/SOCS-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組腎小管細胞表達明顯升高(P＜0.01，F(xiàn)ig 1)，表明 SOCS-1基因成功導入了細胞，并在蛋白水平獲得高效表達。流式細胞術(FCM)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，在刺激的12 h TNF-α組和空載體對照組凋亡細胞明顯增多。與TNF-α和空載體對照組相比，SOCS-1轉(zhuǎn)染組與AG490干預組腎小管上皮細胞凋亡均明顯降低(P＜0.01，F(xiàn)ig 2);TUNEL結(jié)果同流式細胞術結(jié)果一致(P ＜0.01，F(xiàn)ig 3)。

Fig 1 Expression of SOCS-1 in HKC cells(n=6)

2.2 SOCS-1對細胞凋亡相關蛋白表達的影響與正常對照組相比，在刺激的12 h TNF-α組和空載體對照組Caspase-3活性明顯增高，Bax/Bcl-2蛋白比率明顯升高(P均＜0.01)。SOCS-1轉(zhuǎn)染組腎小管上皮細胞Caspase-3活性及Bax/Bcl-2蛋白比率明顯低于TNF-α組和空載體對照組;AG490干預組腎小管上皮細胞Caspase-3活性及Bax/Bcl-2蛋白比率也明顯低于TNF-α組和空載體對照組;AG490干預組和SOCS-1轉(zhuǎn)染組之間表達差異無顯著性(Fig 4)。

2.3 SOCS-1對JAK2和STAT1激活的影響 與正常對照組相比，在刺激的12 h TNF-α組和空載體對照組p-JAK2和p-STAT1表達均明顯升高，TNF-α組和空載體對照組之間表達差異無顯著性。與TNF-α組和空載體對照組相比，SOCS-1轉(zhuǎn)染組與AG490干預組p-JAK2和p-STAT1表達明顯降低(Fig 5)。

Fig 2 Effect of SOCS-1 on TNF-α-induced apoptosis rate of HKC is analyzed by FCM(n=6)

3 討論

細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，也常常被稱為細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)。細胞凋亡是腎功能損傷的重要環(huán)節(jié)，近年來的研究表明，細胞凋亡在細胞生存控制中起重要作用，與多種腎臟疾病的發(fā)生及修復有關［7］。以往對腎臟疾病的研究大多集中在腎小球病變，對腎小管間質(zhì)病變的發(fā)生發(fā)展及其機制研究較少。然而，近來越來越多的關于腎臟疾病長期預后的研究證據(jù)表明，腎小管間質(zhì)的病變程度與腎臟疾病較腎小球病變有更為密切的相關性。有研究提示［8］，腎臟疾病晚期凋亡細胞數(shù)與腎功能惡化程度成正比，成為腎功能進一步惡化的重要因素之一。因此，尋求腎臟疾病中抑制腎小管上皮細胞的凋亡的方法將在一定程度上延緩腎臟疾病的發(fā)展。

Fig 3 Effect of SOCS-1 on TNF-α-induced apoptosis rate of HKC is analyzed by TUNEL(n=6)

Fig 4 Effect of SOCS-1 on activation of Caspase-3，Bax and Bcl-2 in HKC cells(n=6)

Fig 5 Effect of SOCS-1 on TNF-α-induced activation of JAK2 and STAT1 in HKC cells(n=6)

TNF-α是由單核巨噬細胞等分泌產(chǎn)生的細胞因子，在血管內(nèi)皮細胞表面廣泛分布，腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞也可合成和分泌。TNF-α能夠通過第二信使系統(tǒng)激活轉(zhuǎn)錄因子、刺激細胞因子和生長因子及其他炎癥介質(zhì)的合成對腎臟細胞發(fā)揮作用。TNF-α對腎臟細胞具有明顯的毒性，能夠?qū)е履I臟細胞的凋亡和壞死［9］。研究發(fā)現(xiàn)［10］，TNF-α 對HKC的毒性作用呈劑量和時間依賴性;TNF-α(10 mg·L-1)，作用時間8 h，可明顯誘導 HKC凋亡。AL-Rasheed 等［11］在研究中也證實，TNF-α 對負鼠腎臟近端腎小管上皮細胞的活性有明顯抑制作用并呈劑量依賴性，并可誘導其凋亡。我們的實驗結(jié)果也顯示TNF-α能夠誘導人腎小管上皮細胞凋亡，上調(diào)腎小管上皮細胞Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達，同時下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，Bax/Bcl-2蛋白比率增高。

JAK/STAT通路是細胞因子信號傳導的重要途徑，STATs是潛在的轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下存在于細胞質(zhì)內(nèi)，可被 IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、干擾素(IFNs)等多種細胞因子激活。本課題組多年研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT信號通路激活參與了糖尿病腎病的發(fā)病過程，在糖尿病大鼠腎小球及高糖培養(yǎng)的系膜細胞中，JAK/STAT信號通路活性明顯增強［12］。對于JAK/STAT通路與腎小管損傷的關系卻知之甚少。最近研究發(fā)現(xiàn)白蛋白能夠激活體外培養(yǎng)的腎小管細胞的JAK/STAT信號通路［13］。在梗阻性腎病模型，STAT6能夠抑制腎臟細胞凋亡，同時激活膠原合成促進腎小管間質(zhì)纖維化［14］。AGEs能夠通過JAK/STAT信號通路誘導腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化［6］。我們的實驗結(jié)果亦顯示，伴隨 TNF-α誘導HKC凋亡的同時;腎小管上皮細胞JAK2和STAT1的磷酸化水平明顯增高，初步提示JAK/STAT信號通路可能在腎小管損傷導致慢性腎臟疾病過程中發(fā)揮一定作用，但具體的激活機制還有待進一步研究。

細胞因子信號傳導抑制蛋白-1(SOCS-1)是SOCS家族重要成員之一，其發(fā)揮作用主要通過抑制JAK/STAT信號傳導通路的激活［5］。本課題組最近的研究表明［6］，SOCS-1基因轉(zhuǎn)染能夠抑制AGEs誘導的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，減少細胞外基質(zhì)的合成。我們的實驗結(jié)果顯示，SOCS-1轉(zhuǎn)染組 TNF-α誘導的HKC凋亡細胞明顯減少;SOCS-1過表達能夠抑制TNF-α誘導的腎小管細胞JAK2和STAT1的磷酸化，同時降低凋亡相關蛋白質(zhì)Cleaved caspase-3和促凋亡基因Bax的表達、逆轉(zhuǎn)抑凋亡基因Bcl-2的低表達;Bax/Bcl-2蛋白比率亦明顯下降;提示SOCS-1在一定程度上抑制JAK2、STAT1的磷酸化及TNF-α誘導的腎小管上皮細胞的凋亡。本實驗中，我們同時采用了JAK激酶抑制劑AG490進行干預，結(jié)果顯示，AG490干預組腎小管細胞凋亡相關蛋白質(zhì)Cleaved caspase-3表達水平及 Bax/Bcl-2蛋白比率明顯下調(diào)，和SOCS-1過表達的結(jié)果相一致。

綜上所述，SOCS-1基因轉(zhuǎn)染能夠抑制TNF-α誘導的腎小管上皮細胞凋亡，這種作用可能部分是通過抑制JAK/STAT信號通路的活化實現(xiàn)的。

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