血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑用于膿毒癥大鼠的實驗研究

廖麗君，郭建榮，賈東林，喻 君，沈華春

(1.寧波大學醫學院附屬李惠利醫院麻醉科，浙江寧波 315040;2.北京大學

第三醫院麻醉科，北京 100083;3.皖南醫學院附屬弋磯山醫院麻醉科，安徽蕪湖 241001)

膿毒癥時機體發生一系列的炎癥反應和抗炎反應，釋放大量細胞因子和炎癥介質的同時，循環和組織內腎素－血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)高度激活，其在膿毒癥的病理過程中發揮的作用尚未闡明。本研究通過血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensinⅡ 1 receptor，AT1R)拮抗劑氯沙坦(losartan，LOS)在內毒素(LPS)誘導的膿毒癥大鼠的干預效果，探討AT1R拮抗劑在膿毒癥大鼠中的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級♂SD大鼠30只，體質量200～220 g(由寧波大學實驗動物中心提供)。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg－1)后股動、靜脈穿刺置管分別用于動脈測壓和靜脈給藥。將大鼠隨機分成對照組(Control組):生理鹽水，iv，n=10;膿毒癥組(LPS組):細菌內毒素(LPS，O127B8，Sigma 公司)12 mg·kg－1，iv，n=10;氯沙坦組(LOS組):氯沙坦(MSD 公司)50 mg·kg－1ip，30 min 后LPS 12 mg·kg－1iv，n=10。實驗全程監測平均動脈壓(MAP)、心率及呼吸的變化。膿毒癥模型制作成功的標志是以注射LPS后大鼠MAP下降25%～30%并能維持該水平為標準。LPS注射6 h后采血待檢，隨即處死大鼠取出胸主動脈立即放入液氮速凍，然后轉入－80℃備檢。

1.2 檢測指標及方法 注射LPS 6 h后各組大鼠心臟穿刺采血5～6 ml檢測下述指標:①硝酸鹽還原酶法測定血漿一氧化氮(nitric oxide，NO)濃度;②TBA法測定血漿丙二醛(MDA)濃度;③ 酶聯免疫(ELISA)法測定細胞因子IL-1β及TNF-α的血漿濃度。④逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測大鼠胸主動脈IκB mRNA的表達，各組PCR反應產物經凝膠電泳、圖譜掃描后，采用Totalab圖像分析軟件對PCR電泳掃描圖進行分析，以IκB mRNA的積分光密度值與β-actin mRNA的積分光密度值的比值表示 IκB mRNA的表達水平。⑤ Western blot法檢測大鼠胸主動脈IκB蛋白的表達。胸主動脈勻漿裂解后依次進行蛋白定量、電泳分離、轉膜、封閉，加入1∶500稀釋的抗IκB單克隆抗體(SC-371，Santa Cruz公司)孵育，TBST洗膜，加入二抗孵育，TBST洗膜、ECL膠片曝光、顯影、定影。將圖片進行密度掃描，以IκB的積分光密度值與β-actin的積分光密度值的比值表示IκB蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 各組大鼠血漿NO、MDA、IL-1β及TNF-α濃度的變化 與對照組比較，LPS組NO、MDA、IL-1β及TNF-α的血漿濃度均明顯升高(P＜0.01)，而在LOS治療組中，以上各指標均較LPS組明顯回落(P＜0.01)，但仍較正常大鼠升高(P＜0.01)。見Tab 1。

Tab 1 Plasma concentrations of NO，MDA，IL-1β and TNF-α in each group(±s，n=10)

Tab 1 Plasma concentrations of NO，MDA，IL-1β and TNF-α in each group(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs LPS

Group NO/μmol·L －1 MDA/μmol·L －1 IL-1β/μg·L－1 TNF-α/μg·L －1 Control 53.7 ±8.35.48 ±0.5 92.6±10.6 78.4±25.7 LPS 545±78.7＊＊ 19.2±3.6＊＊ 564.9±51.8＊＊ 724.8±75＊＊LOS 269.7 ±29.9＊＊## 10.8±1.1＊＊## 371.5±47.4＊＊##489.8±56.3＊＊##

2.2 各組大鼠胸主動脈IκB mRNA和蛋白的表達情況 與正常對照組比較，靜脈注射LPS誘導而成的膿毒癥大鼠胸主動脈IκB mRNA的表達(189±27)和蛋白的表達(77±12)均受到明顯抑制(P＜0.01)，分別下降了31.5%和42.9%;而在 LOS治療組中，大鼠胸主動脈 IκB mRNA的表達(233±25)較 LPS組升高了23.3%(P＜0.01)，IκB 蛋白的表達(103±13)較 LPS組升高了 33.8%(P＜0.01)，但治療組IκB mRNA和蛋白的表達仍未恢復到正常水平，明顯低于對照組(P＜0.01)，見Tab 2、Fig 1、2。

Tab 2 Expressions of IκB mRNA and protein in rat aortas of each group(±s，n=10)

Tab 2 Expressions of IκB mRNA and protein in rat aortas of each group(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs LPS

B Pro Control 276±35 135±14 Group IκB mRNA Iκ LPS 189±27＊＊ 77±12＊＊LOS 233±25## 103±13##

Fig 1 Expressions of IκB mRNA in rat aortas of each group

Fig 2 Expressions of IκB protein in rat aortas of each group

3 討論

膿毒癥模型的制作有多種方法，我們采用靜脈內一次性注射大劑量的LPS誘導膿毒癥的模型，與直接給予細菌或盲腸結扎并穿孔等制作方法比較，模型穩定、便于膿毒癥的嚴重階段的實驗研究，與我們以往報道基本一致［1］。炎癥介質過度釋放、炎癥反應失控是膿毒癥的中心環節，即使病因去除病程仍在進展，容易演變成膿毒性休克和多器官功能障礙，病情兇險，死亡率高［2］。因此如何干預或阻止膿毒癥的惡化進程成為近來研究的熱點。

腎素－血管緊張素系統(RAS)可獨立存在于血管、心臟、腎臟等局部組織器官中，作為激素的血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)被證實也是一種促炎因子，在膿毒癥嚴重階段機體RAS系統異常激活，AngⅡ在血漿和局部組織器官內急劇增高［3］，其生物學作用主要依賴AT1R介導，促使大量促炎細胞因子、活性氧族、脂質過氧化物等生成，嚴重損害組織細胞［4－5］。本研究檢測出膿毒癥大鼠血漿IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子濃度明顯升高，自由基NO及脂質過氧化物MDA的血漿濃度也比對照組明顯升高，這與以往的報道基本一致［6－7］。當應用AT1R拮抗劑氯沙坦干預膿毒癥大鼠后，發現IL-1β、TNF-α及NO、MDA等的血漿濃度均明顯回落，可見過度激活的RAS受到抑制后，機體炎癥反應得到一定的控制，同時NO釋放減少，脂質過氧化程度也降低，從而控制或延緩膿毒癥的病理進程。為進一步探討AT1R拮抗劑對膿毒癥大鼠的可能保護機制，本研究選用了NF-κB的主要抑制蛋白IκB進行評價。LPS作為病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)與其模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)結合后通過多條信號轉導途徑介導 NF-κB 活化［8］，而 NF-κB 參與了炎癥過程中多種信號轉導途徑，IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子的生成大多受 NF-κB的調控［9］，并且NF-κB與促炎細胞因子形成一個循環放大的過程［10］，此外，LPS、NF-κB 及促炎細胞因子都能激活誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，活化的iNOS刺激血管內皮細胞、平滑肌細胞、單核/巨噬細胞等大量合成釋放NO從而加重膿毒癥的病理反應［11］，因此干預NF-κB的活化成為研究的熱點。在本實驗中通過RT-PCR和Western blot方法發現感染性休克時大鼠胸主動脈IκB mRNA和蛋白的表達均明顯下調，并且蛋白表達下降的幅度較mRNA更為明顯，推測IκB蛋白表達低下除了與基因轉錄水平下調有關外，還與IκB蛋白部分被磷酸化轉化成p-IκB相關，從而促使活性 IκB絕對數量低下，導致 NF-κB大量激活發揮系列生物學作用。當應用氯沙坦干預后，膿毒癥大鼠IκB mRNA和蛋白的表達均明顯升高。由此推測，異常激活RAS受到抑制后，表達上調的IκB在胞質中與NF-κB二聚體結合形成復合物，抑制NF-κB進入細胞核發揮轉錄激活作用，并且也可直接在細胞核內抑制NF-κB與DNA的結合，甚至還能夠將NF-κB復合體從DNA上移開，與NF-κB 結合后使得 NF-κB/IκB 復合體從核內排出［12］，導致 NF-κB 的生物活性明顯降低。

綜上所述，AT1受體拮抗劑通過抑制過度激活的RAS系統，減輕促炎細胞因子、自由基NO和脂質過氧化物等對膿毒癥大鼠產生明顯的抗炎作用，該保護作用可能與其提高IκB表達繼而降低NF-κB的活性相關。

［1］ 廖麗君，景 亮.抗氧化劑對內毒素性休克大鼠α1-腎上腺素能受體mRNA表達的影響［J］.中華麻醉學雜志，2006，26(2):155－8.

［1］ Liao L J，Jing L.Effect of antioxidant on the gene expression of α1-adrenergic receptors during endotoxic shock in rats［J］.Chin J Anesth，2006，26(2):155 －8.

［2］ Shapiro N，Howell M D，Bates D W，et al.The association of sepsis syndrome and organ dysfunction with mortality in emergency department patients with suspected infection［J］.Ann Emerg Med，2006，48(5):583 －90.

［3］ Bregonzio C，Armando I，Ando H，et al.Anti-inflammatory effects of angiotensinⅡAT1 receptor antagonism prevent stress-induced gastric injury［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003，285(2):414－23.

［4］ Ferrario C M，Strawn W B.Role of the renin-angiotensin-aldosterone system and proinflammatory mediators in cardiovascular disease［J］.Am J Cardiol，2006，98(1):121 －8.

［5］ Mehta P K，Griendling K K.AngiotensinⅡ cell signaling:physiological and pathological effects in the cardiovascular system［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(1):82 －97.

［6］ Sanchez-lemus E，Murakami Y，Larrayoz-Roldan I M，et al.AngiotensinⅡAT1 receptor blockade decreases lipopolysaccharide-induced inflammation in the rat adrenal gland［J］.Endocrinology，2008，149(10):5177 －88.

［7］ Sang H，Wallis G L，Stewart C A，et al.Expression of cytokines and activation of transcription factors in lipopolysaccharide-administered rats and their inhibition by phenyl N-tert-butylnitrone(PBN)［J］.Arch Biochem Biophys，1999，363(2):341 －8.

［8］ Cauwels A.Nitric oxide in shock［J］.Kidney Int，2007，72(5):557－65.

［9］ 馬悅穎，劉建勛.AS炎性信號通路與中藥干預［J］.中國藥理學通報，2011，27(6):745 －7.

［9］ Ma Y Y，Liu J X.Progression on inflammatory signaling pathway of atherosclerosis and the intervention of TCM［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(6):745 － 7.

［10］劉 義，吳昆鵬，楊巧珠，等.小分子肽(KP)對小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1增殖分化及NF-κB表達的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27(3):423 －7.

［10］ Liu Y，Wu K P，Yang Q Z，et al.The effect of the small molecular weight peptide(KP)on the proliferation，differentiation of mouse MC3T3-E1 cells and the expression of NF-κB［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(3):423 －7.

［11］ Fernandes D，Assreuy J.Nitric oxide and vasular reactivity in sepsis［J］.Shock，2008，30(1):10 －3.

［12］ Shen L，Mo H，Cai L，et al.Losartan prevents sepsis-induced acute lung injury and decreases activation of nuclear factor κB and mitogen-activated protein kinases［J］.Shock，2009，31(5):500 －6.