HPLC法測定清熱醒腦靈片中梔子苷的含量

劉清新 ，于永軍 ，焦 艷 ，潘海霞

1.滄州醫學高等專科學校，河北滄州 061001；2.滄州市藥檢所，河北滄州 061001

清熱醒腦靈片由水牛角、黃芩、黃連、冰片、梔子等十三味藥組成，具有清熱解毒，開竅醒腦，息風安神之效，可用于腦炎、高血壓及各種高熱的治療[1]，并收載于衛生部標準中藥成方制劑第八冊，于1993年頒布執行。原質量標準中只有顯微法鑒別、化學法鑒別及常規檢查，未對任何藥物或有效成分進行含量測定。本實驗采用HPLC法對清熱醒腦靈片處方中梔子所含的主要成分梔子苷進行含量測定，為該制劑的質量控制提供科學依據，保障臨床用藥的安全有效。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀 （G1315B型DAD檢測器，G1311A型泵，G1311A自動進樣器，G1316A柱溫箱），Hypersil ODS2 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；TU1810型紫外可見分光光度計；BS124S型電子分析天平；KH-3200DB型超聲波清洗儀。

梔子苷對照品 （中國藥品生物制品檢定所，批號：110749-200714，供含量測定用），乙腈為色譜純（天津市光復精細化工研究所），清熱醒腦靈片（河北天成藥業有限公司生產，批號：20090212、20090310、20090320），陰性樣品為自制；水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Hypersil ODS2 C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：20℃；檢測波長 238 nm；流動相：乙腈-水（15∶85）[2-3]；理論板數按梔子苷峰計算應不低于1500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成300 μg/ml的溶液，作為對照品儲備液。精密量取上述儲備液適量，加甲醇稀釋制成30 μg/ml的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱取粉末適量（約相當于1片重量），置25 ml容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取不含梔子的陰性樣品，按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.3 空白干擾試驗

取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖1。

2.4 線性關系試驗

精密量取對照品儲備液 1、2、5、8、10、15 ml，分別置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，以梔子苷濃度C為橫坐標，以峰面積A為縱坐標進行線性回歸。見圖2。

圖1 空白干擾試驗色譜圖

由圖1可知，其他原輔料對梔子苷的含量測定無干擾。

圖2 線性關系試驗

由試驗結果可知，梔子苷溶液在6.36～95.40 μg/ml濃度范圍內與其峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為A=24.62C+19.77（r=0.9999，n=6）。

2.5 精密度試驗

取對照品溶液，連續進樣6次，測定峰面積。結果顯示，各峰面積的RSD值為0.42%。

2.6 重復性試驗

取批號為20090212的樣品，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件分別測定含量，共測定5份。結果顯示，其平均含量為0.500 mg/片，RSD為0.67%。

2.7 穩定性試驗

取供試品溶液，在 20℃條件下，分別于 0、1、2、4、8 h，精密量取20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定梔子苷峰面積。結果顯示，各峰面積的RSD值為0.83%，表明供試品溶液在20℃條件下8 h內穩定。

2.8 回收率試驗

按2片重量的80%、100%、120%稱取供試品細粉，每一濃度稱取3份樣品，加甲醇25 ml，超聲處理30 min，過濾，精密量取續濾液5 ml，精密加入梔子苷對照品溶液5 ml，混勻，作為供試溶液。分別取上述供試品溶液和梔子苷對照品溶液，按照含量測定項下方法測定。見表1。

表1 梔子苷回收率試驗結果

由表1結果可知，本法梔子苷回收率較好。

2.9 樣品含量測定

取本品樣品3批，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件分別測定含量。見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的確定

取濃度為30 μg/ml的梔子苷對照品甲醇溶液，采用分光光度法在200～400 nm的波長范圍內進行紫外掃描，結果本品在237.5 nm波長處有最大吸收。參照梔子含量測定項下方法[2]及相關文獻報道[3-4]，確定梔子苷含量測定的檢測波長為238 nm。

3.2 超聲提取時間的選擇

參考有關文獻報道[5-6]，在制備供試品溶液時，取同一批號樣品，以甲醇為溶劑超聲提取 10、20、30、40 min，在同一色譜系統及色譜條件下試驗，結果各樣品的平均含量分別為0.435、0.449、0.494、0.496 mg/片，表明 30 min 時梔子苷基本提取完全，故確定超聲提取時間為30 min。

綜上所述，本實驗建立的清熱醒腦靈片中梔子苷的HPLC含量測定方法，經方法學驗證結果表明，本法專屬性好，靈敏度高，穩定性及重復性均符合含量測定要求，且操作簡便，可以作為清熱醒腦靈片的一個質量控制方法。

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準[S].中藥成方制劑:第8冊,1993:175.

[2]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京:化學工業出版社,2005:173.

[3]劉寧.HPLC法測定解郁安神片中梔子苷的含量[J].中國藥品標準,2008,9(6):467-469.

[4]邵燕虹,宋麗莉,周燕雙.HPLC法測定清熱暗瘡丸中梔子苷的含量[J].醫學綜述,2008,14(22):3518-3519.

[5]張大軍,王兆華.高效液相色譜法測定復腎寧片中梔子苷的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(12):88-89.

[6]黃曉丹,傅英,陳禧翎,等.HPLC法測定清開靈膠囊中梔子苷的含量[J].中國中醫藥信息雜志,2009,16(6):52-53.