燈盞乙素苷元4′－N－取代氨甲基苯甲酸酯的合成與活性研究＊

邢鳳晶，張 偉，傅曉鐘，蘭燕宇，王愛民，王永林，李 靖，周 雯，劉 影

(貴陽醫學院藥學院，貴州 貴陽 550004)

研究證實，氧化損傷是神經退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)與血管性癡呆(vascular dementia，VD)等產生的關鍵因素[1-2]。燈盞乙素可顯著改善海馬區神經元的形態，減輕腦組織的過氧化損傷[3]，從而對神經退行性疾病的治療具有重要價值，但其水溶性差(0.056 g/L)、脂溶性差、pH=4.2的磷酸鹽緩沖液中logP為-2.56、口服生物利用度低(0.4%)等缺陷，使其推廣應用受到較大限制[4-5]。口服燈盞乙素后，其體內真正的吸收與藥效形式是燈盞乙素苷元[6];在氨基酸結構的氨基和羧基之間引入苯環，能有效克服氨基酸衍生物因鄰近氨基與羧基的參與而在弱酸環境下易水解的缺點，提高前藥的化學穩定性[7]。筆者以燈盞乙素苷元為先導化合物進行結構修飾，以期達到改善其理化性質與提高抗氧化活性的目的，并對受試化合物進行了初步體外活性檢測，報道如下。

1 儀器與試藥

Varian INOVA-400M型核磁共振儀(美國Varian);ACQUITY TQD型超高效液相色譜-質譜聯用儀(美國Waters);LC-10AVP型高效液相色譜儀(日本島津)，Hedera ODS-2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)。4- 氯甲基苯甲酸(批號為 16318)、二氯二苯甲烷(批號為20101028)均為南京康滿林化工有限公司產品;二甲氨基吡啶(批號為 T20090928)、DEME(批號為 F20090218)、二乙胺(批號為T20090122)、芐胺(批號為F20070618)、嗎啉(批號為11033)均購自國藥集團上海化學試劑有限公司;分離用硅膠(未說明者均為200～300目，青島海洋化工分廠);PC12細胞株(中國醫學科學院醫藥生物技術研究所);維生素E(Sigma公司);DMEM高糖培養基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司);乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 化合物的合成

2.1.1 合成路線

合成路線見圖1。

圖1 目標化合物的合成路線

2.1.2 合成步驟

6，7-羥基縮酮保護燈盞乙素苷元的制備:將燈盞乙素苷元0.2 g(0.7 mmol)溶于 10 mL 二甘醇二甲醚(DME)中，加入二甲氨基吡啶(DMAP)0.1 g(0.81 mmol)，加入二氯二苯甲烷 0.49 g(21 mmol)，180℃條件下，回流反應2 h。溶劑減壓蒸盡，殘余物經硅膠柱層析分離(洗脫劑為氯仿∶甲醇=80∶1)，得淺棕黃色粉末狀固體 0.22 g，熔點(mp)250 ～252 ℃，收率 68.4%。

N，N-取代氨甲基苯甲酸(4a～4c)的合成:室溫、氮氣保護下將對氯甲基苯甲酸(4 g，23.4 mmol)置500 mL三頸瓶中，加入40 mL無水乙醇，向反應體系緩慢滴加溶有N-取代胺(93.6 mmol)的無水乙醇溶液19.6 mL，滴畢，體系回流反應24 h，薄層色譜監測反應完全，冷卻，將反應體系濃縮，加入40 mL蒸餾水溶解，加入乙醚萃取2次，每次20 mL，合并水層，冰浴下滴加濃鹽酸，調pH至4～5，析出白色沉淀，抽濾，水洗濾餅，剩余固體用熱異丙醇超聲提取2次，每次30 mL，合并醇層，減壓蒸除溶劑后殘余物以氯仿∶甲醇∶乙酸=15∶1∶0.5(V/V)為洗脫劑經硅膠柱層析分離純化，得N-取代氨甲基苯甲酸。

燈盞乙素苷元4'-N，N-取代氨甲基苯甲酸酯(6a～6c)的合成:將N，N-取代氨甲基苯甲酸(95μmol)置25 mL兩口反應瓶中，加入0.5 mL二甲基亞砜(DMSO)與5 mL四氫呋喃(THF)攪拌至體系完全澄清，后加入二甲氨基吡啶(DMAP，4 mg，33μmol)與縮酮保護的燈盞乙素苷元30 mg(67μmol)，攪拌至體系澄清后滴加含有N，N'-二環己基碳酰亞胺(DCC，17 mg，81μmol)的 3 mL 四氫呋喃溶液，滴畢，室溫攪拌條件下反應14 h。薄層色譜監測至原料轉化完全后，體系減壓濃縮除去四氫呋喃，后用氯仿-水體系萃取3次，洗出體系中二甲基亞砜溶劑，收集氯仿層，無水硫酸鎂干燥1 h后過濾，將濾液濃縮，殘余物以氯仿∶甲醇 =30∶1為洗脫劑，硅膠柱層析分離得6，7-二苯縮酮保護燈盞乙素苷元-4'-氨甲基苯甲酸酯(5a～5c)。在25 mL干燥的茄形瓶中，加入3 mL乙酸乙酯，冰鹽浴(-5℃)攪拌下，依次加入甲醇(0.03 mL，0.7 mmol)、乙酰氯(0.028 mL，0.4 mmol)，保溫反應3 h，向反應體系中滴加含有6，7-二苯縮酮保護燈盞乙素苷元-4'-取代氨甲基苯甲酸酯(0.04 mmol)的2 mL乙酸乙酯溶液，保溫反應2 h后升至室溫反應12 h，有黃色沉淀物附著于壁，加適量乙酸乙酯超聲、洗滌并真空干燥，得到目標化合物6a～6c。

2.2 化合物的鑒定

化合物6a:燈盞乙素苷元4'-N-取代對二乙氨甲基苯甲酸酯。淺黃色固體，產率 52.6% ，mp 為 270-272 ℃ 。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.67(brs， 1H， 5-OH)， 10.67(brs， 1H， 7-OH)，8.68(brs，1H，6-OH)，8.29-8.17(m，4H，Ar'-H3，5，Ar″-H3，5)，7.89(d，J=8.0 Hz，2H，Ar'-H2，6)，7.53(d，J=8.4 Hz，2H，Ar″-H2，6)，6.97(s， 1H， Ar-H8)， 6.65(s，1H， Ar-H3)， 3.76(s， 2H， Ar″-CH2N)，3.06(m，4H，2 ×NCH2CH3)，1.25-1.23(m，6H，2 ×CH3)。ESI-MS(m/z)[M-H]-:474.2。

化合物6b:燈盞乙素苷元4'-N-取代對芐氨甲基苯甲酸酯。黃色粉末，產率 46.7% ，mp 為 300℃ (dec.)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.63(brs， 1H， 5-OH)， 10.70(brs， 1H， 7-OH)，8.83(brs，1H，6-OH)，8.28-8.23(m，4H，Ar'-H3，5，Ar″-H3，5)，7.79(d，J=8.8 Hz，2H，Ar'-H2，6)，7.57-7.55(m，5H，Ph-5H)，7.51(d，J=8.8 Hz，2H，Ar″-H2，6)，6.97(s，1H，Ar-H8)，6.66(s，1H，Ar-H3)，4.29(s，2H，Ar″-CH2N)，4.18(s，2H，CH2Ph)。ESIMS(m/z)[M-H]-:508.5。

化合物6c:燈盞乙素苷元4'-N-取代對嗎啉甲基苯甲酸酯。黃色粉末，產率 56.4% ，mp 為 300 ℃ (dec.)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.63(brs， 1H， 5-OH)， 10.65(brs， 1H， 7-OH)，8.31(brs，1H，6-OH)，8.31-8.17(m，4H，Ar'-H3，5，Ar″-H3，5)，7.83(d，J=7.2 Hz，2H，Ar'-H2，6)，7.52(d，J=8.8 Hz，2H，Ar″-H2，6)，6.98(s， 1H， Ar-H8)， 6.65(s，1H， Ar-H3)， 3.92(s， 2H， Ar″-CH2N)，3.75(m，4H，2 ×CH2O)，2.52(m，4H，2×CH2N)。ESI-MS(m/z)[M-H]-:488.1。

2.3 化合物的藥理活性研究

2.3.1 MTT 法檢測細胞毒性

將PC12細胞消化為單個細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/mL，接種于 96孔板(100 μL/孔)，于 37℃和 5%CO2培養箱培養過夜。待細胞貼壁后吸去上清，加入含濃度梯度稀釋藥物(1，10，50，100μmol/L)的培養液，置培養箱中繼續培養。于加藥后24 h，吸去上清液，加入含MTT(0.25 g/L)無血清培養基，培養4 h，吸去培養液，加入100 μL二甲基亞砜振蕩使Formazan結晶溶解，490 nm波長處測定各孔吸光值，計算細胞半數毒性濃度(TC50)。結果見表1。

2.3.2 LDH 漏出率試驗

選取對數生長期PC12細胞，以每孔100μL，5×104～10×104個/mL種植于96孔培養板中，將培養板置37℃和5%CO2培養箱中孵育24 h。試驗分為正常對照組、陽性對照組、加藥組。過濾培養基后，取細胞板，小心吸去培養液，換液加藥。正常對照組每孔加入100 μL的DMEM培養液;模型組每孔加入含有1000μmol/L H2O2的培養液 100 μL，陽性對照組每孔加入含有 1000μmol/L H2O2及20μmol/L維生素 E的培養液 100 μL;加藥組每孔加入含有1000μmol/L H2O2及 1，10，20μmol/L 受試化合物的培養液100 μL，作用PC12細胞6 h后用酶標儀檢測490 nm波長處每孔吸光度值，計算LDH釋放率。LDH釋放率(%)=上清液LDH/(上清液LDH+裂解液LDH)×100%。每個質量濃度平行3孔，試驗重復3次。數據采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。結果見表1。結果顯示，與陽性對照組比較，化合物6a，6b，6c都具有明顯的抗氧化作用;與燈盞乙素對照組比較，化合物6c的抗氧化活性更高。

3 討論

研究中，以燈盞乙素苷元為原料，通過其與二氯二苯甲烷經縮合反應，制備6，7-二苯縮酮縮酮保護燈盞乙素苷元;對氯甲基苯甲酸與取代胺在無水乙醇條件下回流反應24 h，經后處理、純化得N，N-取代氨甲基苯甲酸;以6，7-二苯縮酮縮酮保護燈盞乙素苷元與N，N-取代氨甲基苯甲酸為反應原料，在通用縮合劑N，N'-二環己基碳酰亞胺(DCC)/二甲基吡啶(DMAP)作用下縮合后，經乙酰氯/甲醇體系脫保護基，獲得目標化合物，經1H-NMR、ESIMS檢測，表明合成的化合物與目標產物結構一致;通過對H2O2誘導損傷PC12細胞的保護作用如四甲基偶氮唑鹽比色法、乳酸脫氫酶釋放率的測定，以維生素E、燈盞乙素以及燈盞乙素苷元作為對照評價設計化合物抗氧化活性。

表1 化合物藥理活性研究結果

N-取代氨甲基苯甲酸制備過程中，采用了文獻[7]報道的合成方法，即4-氯甲基苯甲酸與取代胺在無水乙醇條件下縮合后，體系蒸干后加入4 mol/L NaOH溶液溶解、乙醚萃取除去雜質，水層調酸至產物析出后重結晶，但從試驗結果來看目標化合物N-取代氨甲基苯甲酸收率極低(＜5%)，而主要得到4-羥甲基苯甲酸。經過改進后我們將反應體系蒸干溶劑、加水溶解、水層用乙醚洗滌，后用濃鹽酸調pH至4～5，至沉淀析出后抽濾，水洗濾餅，剩余固體用熱異丙醇超聲提取，提取液蒸除溶劑后，殘余物采用氯仿 ∶甲醇 ∶乙酸(15∶1∶0.5，v/v)為洗脫劑，經硅膠柱層析分離純化，獲得目標產物N-取代氨甲基苯甲酸，收率為30～82%。對新化合物的體外活性，采用了經典的過氧化氫誘導PC12細胞損傷模型，遴選出具有明顯活性的新化合物。筆者認為，該化合物的藥效學、藥代動力學值得進一步深入研究。

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