通淋片薄層鑒別與定量測定研究

李曉燕，李正杰，許紅輝，趙韶華

(河北以嶺醫藥研究院，河北 石家莊 050035)

通淋片為我公司研發的中藥6類新藥，由黃芩、柴胡、大黃、苦參、烏藥、川牛膝等10味中藥組方，具有疏解肝經氣滯、清化下焦濕熱的功能，主要用于治療急性下尿路感染，療效顯著。為有效控制產品質量，對方中柴胡、大黃、苦參、烏藥進行了薄層色譜(TLC)研究，采用高效液相色譜(HPLC)法對黃芩中黃芩苷進行定量研究，建立了通淋片的質量控制方法，現報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 515型Pump高效液相色譜儀;Waters 2487 Dual λAbsorbemce Detector;AT201型Mettler－toledo電子天平;KQ－250B型超聲波清洗器。通淋片(石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號為20061101);黃芩苷對照品(批號為為715200211)，苦參堿對照品(批號為110805200306)，柴胡對照藥材(批號為1209920301)，大黃對照藥材(批號為120902200408)，烏藥對照藥材(批號為121096200402)，均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇(色譜純)，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 柴胡

取本品5片，研細，加甲醇20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣用水15 mL溶解，用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇層，用3%氫氧化鈉溶液20 mL洗滌1次，棄去氫氧化鈉溶液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取柴胡對照藥材0.5 g，加甲醇7 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。另按處方比例和制法制成不含柴胡的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法[1]試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿－甲醇－水(6∶2∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的主斑點，陰性對照品溶液無干擾(見圖1 A)。

2.1.2 苦參

取本品3片，研細，加甲醇7 mL，超聲處理15 min，濾過，取續濾液，作為供試品溶液;另取苦參堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.6 mg的溶液，作為對照品溶液。另按處方比例和制法制成不含苦參的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法[1]試驗，吸取供試品溶液及陰性對照品溶液各5 μL、對照品溶液4 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－乙醇－濃氨(10∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液無干擾(見圖1 B)。

圖1 柴胡和苦參的薄層色譜圖

2.1.3 大黃、烏藥

取大黃對照藥材0.2 g、烏藥對照藥材0.5 g，分別加甲醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，取續濾液作為大黃或烏藥對照藥材溶液。另按處方比例和制法分別制成不含大黃的陰性樣品和不含烏藥的陰性樣品，分別同2.1.2項下供試品溶液制備方法制成大黃或烏藥的陰性對照品溶液。照薄層色譜法[1]試驗，吸取2.1.2項下的供試品溶液與上述對照藥材溶液、陰性供試品溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環乙烷－乙酸乙酯 －甲酸(6∶2∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與大黃對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的主斑點，陰性對照品溶液無干擾(見圖2 A)。再噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與烏藥對照藥材溶液色譜相應位置上至少顯2個相同顏色的斑點，陰性對照品溶液無干擾(見圖 2 B)。

圖2 大黃和烏藥的薄層色譜圖

2.2 定量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry C18柱 (150 mm ×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇－0.1%磷酸(47∶53);流速:1 mL/min;檢測波長:280 nm;理論板數按黃芩苷峰計算應不低于2500。

2.2.2 溶液制備

取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得對照品溶液。取本品10片，除去薄膜衣，精密稱定，研細，取0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率250 w，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 mL，置25 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。另取方中除黃芩之外的其他藥材，按照制備工藝制得陰性樣品，采用供試品溶液的處理方法進行處理，制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

陰性干擾試驗:精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測定。結果陰性對照不干擾黃芩苷的測定，高效液相色譜圖見圖3。

圖3 高效液相色譜圖

標準曲線繪制:分別精密吸取對照品溶液(0.2228g/L)1，2，3 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，再分別精密吸取(0.02228g/L)的對照品溶液各1 mL，分別置2 mL及5 mL的容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，精密吸取上述對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(Y)、黃芩苷進樣量(ng)為橫坐標(X)繪制標準曲線，得回歸方程Y=74232.021+3777.5469 X，r=0.99991。結果表明，黃芩苷進樣量在89.12～1336.80 ng范圍內與峰面積積分值具良好的線性關系。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20 μL，在上述色譜條件下連續進樣5次，測定峰面積。結果對照品溶液的RSD為0.45%，供試品溶液的 RSD為0.68%(n=5)。

穩定性試驗:精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20 μL，分別于0，2，6，12，15 h時進樣，測定峰面積。結果對照品溶液的 RSD為0.80%，供試品溶液 RSD為2.33%(n=5)，表明黃芩苷在15 h內檢測，峰面積穩定。

重復性試驗:取同一批樣品 9 份，分別取高(0.36 g)、中(0.30 g)、低(0.24 g)3個劑量，按供試品溶液的制備方法進行制備、測定。結果樣品中黃芩苷的平均含量為22.53 mg/g，RSD為2.38%，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:取同一批樣品9份，分為3組，分別精密加入25 mL不同質量濃度的黃芩苷對照品的70%甲醇溶液，超聲提取，測定，計算回收率。結果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗結果(n=9)

2.2.4 樣品含量測定

用所擬訂的含量測定方法，對3批通淋片進行了黃芩苷含量測定，結果3批樣品的平均含量為18.89 mg/g。

3 討論

苦參堿鑒別一般選擇苯或氯仿作展開劑，本研究首次發現，用乙酸乙酯－乙醇－濃氨(10∶1∶0.5)作展開劑，斑點清晰、圓整、分離較好，毒性降低，利于環保。大黃的主要成分為蒽類衍生物，烏藥的主要成分為呋喃倍半萜及其內酯等，二者成分不同，但本研究采用相同的供試品制備方法、相同的展開劑進行展開，采用不顯色檢測大黃斑點、顯色后檢測烏藥斑點的處理方法來鑒別大黃和烏藥，方法簡便、快捷。

黃芩苷含量測定時，樣品處理方法簡單，色譜峰分離度好，精密度高。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，2005:附錄31－附錄32.