通淋片薄層鑒別與定量測定研究

李曉燕，李正杰，許紅輝，趙韶華

(河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035)

通淋片為我公司研發(fā)的中藥6類新藥，由黃芩、柴胡、大黃、苦參、烏藥、川牛膝等10味中藥組方，具有疏解肝經(jīng)氣滯、清化下焦?jié)駸岬墓δ埽饕糜谥委熂毙韵履蚵犯腥荆熜э@著。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，對方中柴胡、大黃、苦參、烏藥進(jìn)行了薄層色譜(TLC)研究，采用高效液相色譜(HPLC)法對黃芩中黃芩苷進(jìn)行定量研究，建立了通淋片的質(zhì)量控制方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 515型Pump高效液相色譜儀;Waters 2487 Dual λAbsorbemce Detector;AT201型Mettler－toledo電子天平;KQ－250B型超聲波清洗器。通淋片(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號為20061101);黃芩苷對照品(批號為為715200211)，苦參堿對照品(批號為110805200306)，柴胡對照藥材(批號為1209920301)，大黃對照藥材(批號為120902200408)，烏藥對照藥材(批號為121096200402)，均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇(色譜純)，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 柴胡

取本品5片，研細(xì)，加甲醇20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)盟?5 mL溶解，用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇層，用3%氫氧化鈉溶液20 mL洗滌1次，棄去氫氧化鈉溶液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取柴胡對照藥材0.5 g，加甲醇7 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。另按處方比例和制法制成不含柴胡的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿－甲醇－水(6∶2∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對照品溶液無干擾(見圖1 A)。

2.1.2 苦參

取本品3片，研細(xì)，加甲醇7 mL，超聲處理15 min，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液;另取苦參堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.6 mg的溶液，作為對照品溶液。另按處方比例和制法制成不含苦參的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，吸取供試品溶液及陰性對照品溶液各5 μL、對照品溶液4 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－乙醇－濃氨(10∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照品溶液無干擾(見圖1 B)。

圖1 柴胡和苦參的薄層色譜圖

2.1.3 大黃、烏藥

取大黃對照藥材0.2 g、烏藥對照藥材0.5 g，分別加甲醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，取續(xù)濾液作為大黃或?yàn)跛帉φ账幉娜芤骸Ａ戆刺幏奖壤椭品ǚ謩e制成不含大黃的陰性樣品和不含烏藥的陰性樣品，分別同2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成大黃或?yàn)跛幍年幮詫φ掌啡芤骸Ｕ毡由V法[1]試驗(yàn)，吸取2.1.2項(xiàng)下的供試品溶液與上述對照藥材溶液、陰性供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)乙烷－乙酸乙酯 －甲酸(6∶2∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與大黃對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對照品溶液無干擾(見圖2 A)。再噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與烏藥對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上至少顯2個相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照品溶液無干擾(見圖 2 B)。

圖2 大黃和烏藥的薄層色譜圖

2.2 定量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry C18柱 (150 mm ×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇－0.1%磷酸(47∶53);流速:1 mL/min;檢測波長:280 nm;理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.2.2 溶液制備

取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得對照品溶液。取本品10片，除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，取0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 w，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置25 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。另取方中除黃芩之外的其他藥材，按照制備工藝制得陰性樣品，采用供試品溶液的處理方法進(jìn)行處理，制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn):精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測定。結(jié)果陰性對照不干擾黃芩苷的測定，高效液相色譜圖見圖3。

圖3 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別精密吸取對照品溶液(0.2228g/L)1，2，3 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，再分別精密吸取(0.02228g/L)的對照品溶液各1 mL，分別置2 mL及5 mL的容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，精密吸取上述對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)、黃芩苷進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=74232.021+3777.5469 X，r=0.99991。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在89.12～1336.80 ng范圍內(nèi)與峰面積積分值具良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20 μL，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。結(jié)果對照品溶液的RSD為0.45%，供試品溶液的 RSD為0.68%(n=5)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20 μL，分別于0，2，6，12，15 h時進(jìn)樣，測定峰面積。結(jié)果對照品溶液的 RSD為0.80%，供試品溶液 RSD為2.33%(n=5)，表明黃芩苷在15 h內(nèi)檢測，峰面積穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品 9 份，分別取高(0.36 g)、中(0.30 g)、低(0.24 g)3個劑量，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備、測定。結(jié)果樣品中黃芩苷的平均含量為22.53 mg/g，RSD為2.38%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取同一批樣品9份，分為3組，分別精密加入25 mL不同質(zhì)量濃度的黃芩苷對照品的70%甲醇溶液，超聲提取，測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.4 樣品含量測定

用所擬訂的含量測定方法，對3批通淋片進(jìn)行了黃芩苷含量測定，結(jié)果3批樣品的平均含量為18.89 mg/g。

3 討論

苦參堿鑒別一般選擇苯或氯仿作展開劑，本研究首次發(fā)現(xiàn)，用乙酸乙酯－乙醇－濃氨(10∶1∶0.5)作展開劑，斑點(diǎn)清晰、圓整、分離較好，毒性降低，利于環(huán)保。大黃的主要成分為蒽類衍生物，烏藥的主要成分為呋喃倍半萜及其內(nèi)酯等，二者成分不同，但本研究采用相同的供試品制備方法、相同的展開劑進(jìn)行展開，采用不顯色檢測大黃斑點(diǎn)、顯色后檢測烏藥斑點(diǎn)的處理方法來鑒別大黃和烏藥，方法簡便、快捷。

黃芩苷含量測定時，樣品處理方法簡單，色譜峰分離度好，精密度高。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄31－附錄32.