氯化鈉原料藥細菌內毒素檢查方法研究

賈瑞波，張興哲，姜素云

(遼寧省大連市藥品檢驗所，遼寧 大連 116021)

氯化鈉作為電解質補充藥，是氯化鈉注射液等大輸液的原料藥以及制藥工業的重要輔料，在2010年版《中國藥典(二部)》中，其仍無細菌內毒素檢查項，而國外藥典對此均有詳細規定。筆者根據2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪⅩM[1]的要求，參照國外藥典最新版本(EP6.0，BP2010，USP32)的標準，對氯化鈉原料藥細菌內毒素檢查方法進行了研究，現報道如下。

1 儀器與試藥

DHG－9075A型電熱干燥箱(上海一恒科技有限公司);旋渦混合器(德國IKA公司);TAL－40D型試管恒溫儀(湛江安度斯生物有限公司)。氯化鈉原料藥(某廠家提供，批號分別為4100901，4100902，4100903);鱟試劑 1(TAL－1，批號為 1002080，規格為0.1 mL/支，靈敏度為 0.25 EU/mL，湛江博康海洋生物有限公司);鱟試劑 2(TAL －2，批號為 1005181，規格為 0.1 mL/支，靈敏度0.25 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司);細菌內毒素工作標準品(WSE，批號為150601－200862，規格為120 EU/支，中國藥品生物制品檢定所);細菌內毒素檢查用水(BET用水，批號為1003210，規格為5 mL/支，湛江博康海洋生物有限公司)。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值確定[2]

2010年版《中國藥典(二部)》收載的以氯化鈉為主藥的注射劑有氯化鈉注射液、濃氯化鈉注射液和復方氯化鈉注射液。根據《臨床用藥須知》及藥品說明書，其臨床用途廣泛，用法用量復雜多樣，難以準確計算出 M值(人每千克體重每小時的臨床最大用藥劑量)。對于體積在100 mL以上的復方靜脈輸液類品種，內毒素限值一般按 0.50 EU/mL 計[2]。2010 年版《中國藥典(二部)》中氯化鈉注射液與復方氯化鈉注射液的細菌內毒素檢查限值均為0.50 EU/mL，根據氯化鈉注射液的濃度0.9%(g/mL)計算得出，氯化鈉原料藥的細菌內毒素限值應小于55 EU/g。2010年版《中國藥典(二部)》中濃氯化鈉注射液的限值為25 EU/g。為保證安全用藥，對于大輸液的原料藥，限值可適當嚴格至計算值的1/3～1/2[1]，在歐美通常以1/10～1/4作為質量控制的監測限值。參考歐洲藥典(EP6.0)和英國藥典(BP2010)的最新版本，均規定氯化鈉的限值為5 IU/g(1個內毒素國際單位IU與1 EU相當)，故擬訂氯化鈉細菌內毒素檢查的限值為5 EU/g。

2.2 鱟試劑靈敏度復核

按2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE的要求對鱟試劑進行了靈敏度復核，經復核，所用鱟試劑的靈敏度測定值均在0.5 λ～2.0 λ 之間，符合規定，結果見表 1。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果

2.3 供試品稀釋濃度范圍計算

目前市售鱟試劑靈敏度范圍一般在0.5～0.03 EU/mL之間，則供試品溶液最大質量濃度 Cmax=λ0.5/L=(0.5 EU/mL)/(5 EU/g)=0.1 g/mL，供試品溶液最小質量濃度 Cmin= λ0.03/L=(0.03 EU/mL)/(5 EU/g)=0.006 g/mL。

2.4 預干擾試驗

將3批氯化鈉用細菌內毒素檢查用水配制并稀釋成0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125 g/mL 的系列質量濃度，作為供試品溶液(NPC);同時每一質量濃度下均制備含有2 λ細菌內毒素的系列溶液;作為供試品陽性對照(PPC)，并設陽性對照和陰性對照。結果見表2。預試驗結果表明，氯化鈉溶液對鱟試劑與細菌內毒素的反應有抑制作用，但當質量濃度稀釋至0.05 g/mL以下時，其抑制作用有可能被排除。

表2 氯化鈉的預干擾試驗結果

2.5 干擾試驗

通過預試驗的結果，初步確定氯化鈉的最大不干擾質量濃度為0.05 g/mL。將氯化鈉用細菌內毒素檢查用水配制成0.05 g/mL的溶液作為供試品溶液，進行正式干擾試驗。使用較低靈敏度(0.25 EU/mL)的鱟試劑，盡量避免供試品所含的內毒素對干擾試驗造成的陽性影響。用細菌內毒素檢查用水和供試品溶液分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成 0.5，0.25，0.125，0.0625 EU/mL 的系列濃度，同時各系列分別以細菌內毒素檢查用水和供試品溶液作陰性對照，依法檢查，結果見表 3。結果表明，ES均在 0.5 λ ～2.0 λ 范圍內，且 E t均在0.5 ES～2.0 ES范圍內。說明3個批號的氯化鈉在0.05 g/mL的質量濃度時對鱟試劑與細菌內毒素的反應無干擾作用。

表3 氯化鈉的干擾試驗結果

2.6 細菌內毒素檢查

根據干擾試驗結果和擬訂的細菌內毒素限值5 EU/g，采用兩個廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑，對3個批號的氯化鈉進行細菌內毒素檢查，依法操作[2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE]，結果均符合規定。結果見表4。

表4 氯化鈉的細菌內毒素檢查結果

3 討論

預干擾試驗以市售鱟試劑靈敏度計算，所得的供試液最大質量濃度 Cmax為0.1 g/mL，但為探索氯化鈉的干擾程度，故往上兩個質量濃度級(0.2，0.4 g/mL)進行考察。0.4 g/mL 的溶液在室溫下為過飽和，故以0.2 g/mL作為起始質量濃度進行預干擾試驗。試驗證明，氯化鈉的最大不干擾質量濃度為0.05 g/mL，可采用凝膠法對氯化鈉進行細菌內毒素檢查。為提高氯化鈉注射制劑臨床使用的安全性和質量可控性，建議在對新版《中國藥典》進行修訂時，考慮增加氯化鈉原料藥的細菌內毒素檢查項。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄212.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:310－325.