Snail基因與食管癌細(xì)胞侵襲遷移能力的相關(guān)性分析

魯秦安，康龍麗

西安文理學(xué)院，陜西西安 710065

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要階段，有證據(jù)表明90%以上的惡性腫瘤最終都是因腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)而導(dǎo)致死亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)許多基因異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，Snail基因就是其中之一。Snail是Snail家族的第一個成員，近年來大量的研究表明，Snail在食管癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤中高表達(dá)[1-5]，并且在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型（EMT）并促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[6]，但是目前國內(nèi)外極少有關(guān)Snail在人類食管癌方面的研究。

本研究通過siRNA干擾的方法抑制人食管癌細(xì)胞EC9706的Snail基因的表達(dá)，進(jìn)一步觀察Snail基因?qū)θ耸彻馨┘?xì)胞侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

食管癌細(xì)胞EC9706（由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家分子腫瘤實驗室提供）用含有10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（購自GIBCO公司）在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，隔夜換液，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。LipofectamineTM 2000購自 Invitrogen公司，Snail-siRNA購自廣州銳博生物公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，RTPCR試劑盒購自Promega公司，內(nèi)參照GAPDH引物及Snail引物由廣州銳博生物公司合成，Transwell孔板購自美國Corning公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

由廣州銳博生物公司合成3條針對Snail的siRNA序列，篩選出其中1條有效的siRNA序列，參照說明書進(jìn)行Snail-siRNA轉(zhuǎn)染。Snail-siRNA序列正義鏈：5’-GCUGCAGGACUCUAAUCCAdTdT-3’；反義鏈：5’-UGGAUUAGAGUCCUGCA GCdTdT-3’。將細(xì)胞分為三組，實驗組：轉(zhuǎn)染時加入Snail特異性siRNA；空白對照組：轉(zhuǎn)染時加入無血清1640培養(yǎng)液500 μl；陰性對照組：轉(zhuǎn)染時加入非特異性siRNA。

1.3 RT-PCR法檢測Snail mRNA的表達(dá)

應(yīng)用RNA提取試劑盒提取總RNA，Snail引物設(shè)計參考文獻(xiàn)并經(jīng)過GeneBank驗證。Snail引物序列上游：5’-TTC TTCGCTACTGCTGCG-3’； 下 游 ：5’-GGGCAGGTATGGAGA GGAAGA-3’，預(yù)擴增片段883 bp。內(nèi)參照GAPDH引物序列上游：5’-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3’； 下游：5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3’，預(yù)擴增片段190 bp。 循環(huán)條件：94℃變性 1 min，56℃退火 40 s，72℃延伸 30 s，40 個循環(huán)后，72℃延伸10 min。產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，照像并掃描分析。

1.4 Western blotting法檢測Snail蛋白的表達(dá)

取蛋白質(zhì)樣品上樣，用12%聚丙烯酰胺凝膠 （SDSPAGE）電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉液于室溫封閉后加入一抗（1∶1000）（羊抗人 Snail），4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記二抗IgG（1∶1000），37℃孵育 1 h，加入化學(xué)發(fā)光液，暗室曝光，顯影，定影。

1.5 細(xì)胞劃痕實驗

將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，待長到完全融合時，用200 μl槍頭在6孔板的底面上沿直線輕輕進(jìn)行劃痕，劃痕后PBS沖洗2次，繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況并照相，以細(xì)胞劃痕愈合百分比表示細(xì)胞的運動能力（0 h的細(xì)胞劃痕愈合為0%）。

1.6 Transwell小室體外侵襲實驗

將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，每個孔下室內(nèi)加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液500 μl，上室加入200 μl細(xì)胞懸液，每組設(shè)5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)12 h，取出Transwell小室，95%乙醇固定，用棉拭子將小室內(nèi)面的基質(zhì)膠擦去，4%的多聚甲醛固定，HE染色，顯微鏡下觀察照相。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞Snail mRNA表達(dá)情況比較

實驗組細(xì)胞Snail mRNA表述條帶明顯暗于陰性對照組及空白對照組 （圖1）。Snail mRNA的相對表達(dá)量=Snail mRNA表達(dá)量/GAPDH表達(dá)量，Snail mRNA在實驗組的相對表達(dá)量為（0.11±0.09），顯著低于空白對照組的（0.61±0.20）及陰性對照組的（0.68±0.24），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；陰性對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。

圖1 三組細(xì)胞Snail mRNA的表達(dá)情況

2.2 三組細(xì)胞Snail蛋白表達(dá)情況比較

實驗組細(xì)胞Snail的蛋白表達(dá)條帶明顯暗于陰性對照組及空白對照組（圖2）。Snail蛋白的相對表達(dá)量=Snail蛋白表達(dá)量/β-actin蛋白表達(dá)量，Snail蛋白在實驗組的相對表達(dá)量為（0.09±0.04），顯著低于空白對照組的（0.61±0.22）及陰性對照組的（0.72±0.16），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；陰性對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 三組細(xì)胞Snail蛋白的表達(dá)情況

2.3 三組細(xì)胞的遷移能力比較

單層細(xì)胞劃痕實驗12 h后，實驗組細(xì)胞的劃痕愈合速度明顯慢于陰性對照組及空白對照組（圖3）。三組細(xì)胞劃痕愈合百分比分別為：實驗組為（32.7±4.5）%；空白對照組為（87.6±4.9）%；陰性對照組為（92.6±2.1）%，實驗組細(xì)胞的遷移能力明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），空白對照組和陰性對照組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 三組細(xì)胞劃痕愈合情況

2.4 三組細(xì)胞侵襲能力的比較

Matrigel膠能在聚碳酸酯微孔濾膜上形成類似哺乳動物基底膜樣結(jié)構(gòu)，因此，EC9706細(xì)胞穿過Matrigel膠的情況可以反映出EC9706細(xì)胞的侵襲能力。Transwell侵襲小室實驗結(jié)果顯示，實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)為（34.0±2.4）個/HP，明顯低于陰性對照組[（72.0±4.7）個/HP]與 空白 對照 組[（75±5.3）個/HP]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；陰性對照組與空白對照組穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明實驗組細(xì)胞的侵襲能力明顯低于空白對照組及陰性對照組（圖4）。

圖4 三組細(xì)胞的侵襲能力情況

3 討論

食管癌是目前常見的消化道惡性腫瘤之一，我國是世界上食管癌的高發(fā)地區(qū)。近年來隨著外科技術(shù)及新輔助治療的飛速發(fā)展，使部分食管癌患者得到了一定治療，但是由于食管癌高侵襲性的生物學(xué)特點，總體來說食管癌仍是一種預(yù)后較差的惡性腫瘤，因此探索控制食管癌細(xì)胞侵襲的相關(guān)機制成為進(jìn)一步提高食管癌療效的關(guān)鍵。目前研究發(fā)現(xiàn)Snail基因與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

Snail是近年來發(fā)現(xiàn)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其屬于轉(zhuǎn)錄抑制子中的Snail超家族，首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型（EMT）并促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。EMT是指上皮細(xì)胞在特定生理病理狀態(tài)下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，發(fā)生于多種病理、生理過程中，例如傷口愈合、胚胎發(fā)育等，近年來大量的研究表明腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與EMT密切相關(guān)[7]。腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移的過程中上皮性腫瘤細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)化成為有能力的間質(zhì)細(xì)胞，從而穿透基底膜進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)而播散轉(zhuǎn)移。研究證實，Snail參與了某些惡性腫瘤的細(xì)胞EMT并且促進(jìn)了其侵襲轉(zhuǎn)移[8]。體外實驗已經(jīng)證實抑制Snail基因的表達(dá)可以顯著降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。將反義Snail轉(zhuǎn)染入鼻咽癌5-8F細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞及卵巢癌HO9810細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞的運動能力顯著降低，并且侵襲細(xì)胞外基質(zhì)的能力也顯著降低，從而限制了腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[9-11]，但是目前國內(nèi)外有關(guān)抑制食管癌細(xì)胞Snail基因的研究甚少。

本研究發(fā)現(xiàn)利用RNA干擾技術(shù)可以顯著降低食管癌EC9706細(xì)胞中Snail的表達(dá)，并且隨著食管癌細(xì)胞Snail mRNA及蛋白表達(dá)的降低食管癌細(xì)胞的侵襲遷移能力隨之明顯下降，這與其他研究中的結(jié)果一致侵襲。研究中筆者證實了Snail與食管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，為食管癌分子轉(zhuǎn)移機制提出了理論依據(jù)，并且為食管癌的靶向治療提供了新的參考靶點。

[1]Usam Y,Satake S,Nakayama F,et al.Snail associated epithelial-mesenchymal transition promotes oesophageal squamous cell carcinoma motility and progression[J].J Path,2008,215(3):330-339.

[2]Come C,Arnoux V,Bibeau F,et al.Roles of the transcription factors snail and slug during mammary morphogenesis and breast carcinoma progression[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2004,9(2):183-193.

[3]Rosivatz E,Becker I,Specht K,et al.Differential expression of the epithelial-mesenchymal transition regulators snail,SIPI,and twist in gastric camer[J].Am J Pathol,2002,161(5):1881-1891.

[4]Roy HK,Kunte DP,Koetsier JL,et al.Chemoprevention of colon carcinogenesis by polyethylene glycol:suppression of epithelial proliferation via modulation of Snail/beta-catenin signaling[J].Mol Cancer Ther,2006,5(8):2060-2069.

[5]Elloul S,Elstrand MB,Nesland JM,et al.Snail,Slug and Smad-interacting protein 1 as novel Parameters of disease ag gressiveness in metastatic ovarian and breast carcinoma[J].Cancer,2005,103(8):1631-1643.

[6]Peinado H,Olmeda D,Cano A.Snail,Zeb and bHLH factors in tumour progression:an alliance against the epithelial phenotype[J].Nat Rev Cancer,2007,7(6):415-428.

[7]Lee JM,Dedhar S,Kalluri R,et al.The epithelial-mesenchymal transition:newinsights in signaling development and disease [J].J Cell Biol,2006,172(7):973-981.

[8]Usami Y,Satake S,Nakayama F,et al.Snail-associated epithelial-mesenchymal transition promotes oesophageal squamous cell carcinoma mortality and progression[J].J Pathol,2008,215(3):330-339.

[9]陳麗,劉求真,邱際華,等.人snail基因RNAi慢病毒載體對鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖和侵襲的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2009,31(2):1151-1154.

[10]劉海,王志強.反義Snail轉(zhuǎn)錄因子抑制肝癌轉(zhuǎn)移[J].世界華人消化雜志,2006,14(35):3409-3413.

[11]金鴻雁,豐有吉.反義Snail轉(zhuǎn)錄因子抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移的實驗研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2005,40(6):400-403.