HPLC法測定氯霉素滴眼液中氯霉素及其氯霉素二醇物含量

倪曉霞，鄭紹忠

解放軍第一七五醫院藥劑科，福建漳州 363000

氯霉素滴眼液是一種臨場常用的廣譜抗生素類眼用制劑，其主要成分氯霉素易水解，產生1-（4-硝基苯基）-2-氨基-1，3-丙二醇（簡稱氯霉素二醇物），致使抗菌活性降低。2010年版《中國藥典》采用HPLC法測定氯霉素含量，但方法復雜，重現性不理想。筆者根據文獻[1-3]，采用RP-HPLC法測定氯霉素滴眼液中氯霉素的含量并檢查氯霉素二醇物雜質的限量，操作簡便，重現性好，結果準確。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀；分析天平BT214S（德國賽多利斯公司）；實驗室超純水系統U-S15；超聲波清洗機（北京天鵬新技術有限公司）；乙腈（HPLC/spectro，TEDIA COMPANY，批號：909910）；氯霉素對照品（中國藥品生物制品鑒定所提供，批號：130555-200602）；氯霉素二醇物（中國藥品生物制品鑒定所提供，批號：130436-200704）；氯霉素滴眼液（本院制劑室配制）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Eclipse XDB-C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相為乙腈-水-冰醋酸（40.0∶60.0∶0.5）[1]；流速為 1.0 ml/min；柱溫為30℃；進樣量為 10 μl；檢測波長為 272 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 氯霉素對照品溶液配制 精密稱取氯霉素對照品54.8 mg，置100 ml容量瓶中，加流動相定容、搖勻，即得濃度為548.0 μg/ml的氯霉素對照品儲備液。精密量取儲備液5.0 ml，流動相稀釋至50.0 ml，即得濃度為54.8 μg/ml的氯霉素對照液。

2.2.2 氯霉素二醇物對照品溶液配制 精密稱取氯霉素二醇物對照品3.9 mg，置100 ml容量瓶中，加流動相定容、搖勻，即得濃度為39.0 μg/ml的氯霉素二醇物對照品儲備液。精密量取儲備液1.0 ml，加流動相稀釋至10.0 ml，即得濃度為3.90 μg/ml的氯霉素二醇物對照液。

2.2.3 樣品供試液配制 精密量取樣品溶液5.0 ml，置250 ml容量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得。

2.3 系統適應性試驗

在上述色譜條件下，取混合對照液（分別精密量取氯霉素對照品儲備液1.0 ml與氯霉素二醇物儲備液5.0 ml，置于潔凈的10 ml容量瓶中，混勻，加流動相稀釋至刻度，搖勻，為對照品混合液）、氯霉素對照液、氯霉素二醇物對照液、樣品溶液分別進樣10 μl，記錄色譜圖。結果表明，氯霉素與氯霉素二醇物的保留時間分別為：2.48 min、1.16 min；理論塔板數分別為7655、3353；分離度為11.015。見圖1。

圖1 氯霉素滴眼液高效液相色譜圖

2.4 線性關系考察

精密量取氯霉素儲備液 0.5、1.0、2.0、2.5、3.5、4.0、5.0 ml置25 ml容量瓶中；精密量取氯霉素二醇物儲備液0.5、1.0、3.0、5.0、6.0、8.0、10.0 ml置 10 ml容量瓶中，分別加流動相定容，搖勻。按上述色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。以對照品質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結果得氯霉素的線性回歸方程為 Y＝15.34X－4.35（r＝0.9999）；氯霉素二醇物的線性回歸方程為 Y＝24.25X－5.03（r＝0.9995）。提示氯霉素的質量濃度在10.96～109.60 μg/ml范圍內與峰面積線性關系良好；氯霉素二醇物的的質量濃度在1.95～39.00 μg/ml范圍內與峰面積線性關系良好，方法可行。

2.5 精密度試驗

分別取氯霉素及其氯霉素二醇物對照品液，按上述色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。結果得氯霉素峰面積RSD為0.055%；氯霉素二醇物峰面積RSD為0.058%。

2.6 重復性試驗

取同一批號（批號：101024）的樣品 1 份，按“2.2.3”項下樣品供試液的制備方法制備供試品溶液，按色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。結果得氯霉素峰面積RSD為0.045%；氯霉素二醇物峰面積RSD為0.038%。

2.7 穩定性試驗

取同一批號（批號：101024）樣品的供試品溶液，分別于0、1、4、8、12、24 h 時，按色譜條件進樣，記錄色譜圖。 結果得氯霉素峰面積RSD為0.36%（n=6）；氯霉素二醇物峰面積RSD為0.42%（n=6）。實驗結果表明樣品的穩定性良好。

2.8 回收率試驗

2.8.1 氯霉素回收率試驗 精密量取氯霉素滴眼液 （批號：101024；氯霉素含量：99.86%）1.0 ml，共 9 份，分別置 100 ml容量瓶中，精密加入低、中、高不同量的氯霉素對照品，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖。見表1。

表1 氯霉素加樣回收率試驗結果

2.8.2 氯霉素二醇物回收率試驗 于潔凈10 ml容量瓶中，精密加入低、中、高不同量的氯霉素二醇物對照品，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖。見表2。

2.9 氯霉素含量測定

取 3 批次氯霉素滴眼液（批號：101024、110212、110308），分別精密量取5.0 ml，置250 ml容量瓶中，加流動相定容，搖勻，按上述色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，按外標法計算含量。見表3。

表2 氯霉素二醇物加樣回收率試驗結果

表3 氯霉素含量測定與氯霉素二醇物檢查結果（%）

2.10 氯霉素二醇物檢查

按上述色譜條件進樣10 μl 氯霉素二醇物對照液，調節檢測靈敏度，使氯霉素二醇物峰的峰高約為滿量程的64%；取 3 批次氯霉素滴眼液（批號：101024、110212、110308）的樣品供試液與氯霉素二醇物對照液，按上述色譜條件依次進樣，記錄色譜圖，供試品溶液中氯霉素二醇物的峰面積應不得大對照品溶液的主峰面積（規定<8.0%）。見表3。

3 討論

光譜圖提示：氯霉素滴眼液中氯霉素在278、272 nm處均有強吸收，氯霉素二醇物在272 nm有最大吸收，本院處方中未添加羥苯乙酯，不存在干擾吸收，故選用272 nm作為檢測波長。筆者曾比較在本實驗室條件下以下幾種流動相的分離效果：乙腈-水-冰醋酸（40.0∶60.0∶0.5）、0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉緩沖溶液-甲醇梯度洗脫[4]、甲醇-水-10%四丁基氫氧化銨溶液（350∶635∶15）、水-甲醇-冰醋酸（55.0∶45.0∶0.1），結果以乙腈-水-冰醋酸（40.0∶60.0∶0.5）為流動相時，氯霉素與氯霉素二醇物有較好的分離度、精密度、重現性和線性回歸，故采用乙腈-水-冰醋酸（40.0∶60.0∶0.5）為流動相。

[1]謝楠,何曉英,張曉明,等.HPLC測定氯霉素滴眼液中氯霉素及氯霉素二醇物的含量[J].華西藥學雜志,2006,21(1):93-95.

[2]張雁,孫映求,王蘭.RP-HPLC法測定氯霉素滴眼液中氯霉素及氯霉素二醇物的含量[J].中國藥品標準,2005,6(2):11-13.

[3]易文琳.反相高效液相色譜法測定氯霉素滴眼液中氯霉素及有關物質的含量[J].中國藥業,2007,16(17):25-26.

[4]國家藥典委員會.中國藥典[M].二部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:1031-1032.