高效液相色譜法測(cè)定當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量

何玲玲

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東佛山 528000）

根據(jù)《中國(guó)藥典》2005年版一部[1]中收載，當(dāng)歸養(yǎng)血丸主要是由當(dāng)歸、白芍、黃芪和地黃等10味藥物組成。其功效為益氣、養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)，臨床上常用于治療氣血兩虛、月經(jīng)不調(diào)等病癥，且療效顯著。《中國(guó)藥典》2005年版的法定標(biāo)準(zhǔn)中僅僅收載了當(dāng)歸的顯微鑒別項(xiàng)及丹皮的薄層鑒別方法，對(duì)含量測(cè)定的監(jiān)控指標(biāo)無相應(yīng)的收錄，不利于相關(guān)的部門控制其藥品的生產(chǎn)和使用質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)[2]報(bào)道的基礎(chǔ)上，將高效液相色譜法測(cè)定阿魏酸含量進(jìn)行深入的方法學(xué)研究，建立更為準(zhǔn)確的阿魏酸含量限度，便于更好地控制該藥品的質(zhì)量。因此，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent-1100型高效液相色譜儀 （安捷倫科技有限公司）；Agilent 1100色譜工作站，紫外光譜檢測(cè)器，Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agirlent進(jìn)樣瓶；分析天平（精密度萬分之一）；TU-1900紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 試藥

甲醇 （北京北化精細(xì)化學(xué)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20091114，色譜純），水為三蒸水，其他試劑均為分析純；阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)：20081123）；當(dāng)歸養(yǎng)血丸 （本院自制，生產(chǎn)批號(hào)分別為091023、091031、091101、091110、091201，091214）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

采用 Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-1.0%冰醋酸溶液為 25∶75，流速：1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：321 nm，柱溫：25℃，進(jìn)樣量為 10.0 μl。理論塔板數(shù)以阿魏酸峰值計(jì)算大于3000。

2.2 供試品溶液制備

分析天平稱取當(dāng)歸養(yǎng)血丸約10 g，精密稱定，加入10 g硅藻土，混合均勻后研細(xì)，置于索式提取器中，加入70%的甲醇溶液200 ml，提取5 h，提取液減壓濃縮至約4 ml，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解后轉(zhuǎn)移至20 ml量瓶中，加入流動(dòng)相定容至刻度，靜置后備用。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱定阿魏酸對(duì)照品0.1 mg，置5 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，靜置備用。

2.4 陰性樣品溶液制備

精密稱定缺當(dāng)歸的樣品，照“2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取阿魏酸對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，考察系統(tǒng)適用性。HPLC色譜圖見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取濃度為 20 μg/ml的阿魏酸對(duì)照品溶液10、20、40、80、160、320 μl，分別至 2 ml量瓶中，加入流動(dòng)相定容至刻度，分別吸取10 μl注入高效液相色譜儀中，記錄其峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=3.84×104X+0.05×104（r=0.9998）。結(jié)果表明阿魏酸含量在0.025～1.200 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10.0 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其平均峰面積，其RSD為0.97%，結(jié)果表明本法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取同一供試品溶液 10.0 μl， 在 0、4、8、12、16、20、24 h各進(jìn)樣1次，其結(jié)果峰面積的RSD為0.76%，表明阿魏酸在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品5份，按照阿魏酸供試品溶液的制備方法制備樣品溶液并測(cè)定阿魏酸的含量，根據(jù)線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果，樣品中阿魏酸的平均含量為0.058 mg/g，RSD為1.62%。結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

稱取已知含量（批號(hào)：091101）的樣品約2.0 g，共6份，精密稱定，分別精密加入阿魏酸對(duì)照品溶液（0.05 mg/g）2.4 ml，按照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定含量，同時(shí)計(jì)算回收率。結(jié)果測(cè)得的阿魏酸的平均回收率為98.69%，RSD為0.96%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery test(n=6)

2.11 樣品含量測(cè)定

取當(dāng)歸養(yǎng)血丸樣品，按照供試品溶液的制備方法制備溶液，精密稱取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中。阿魏酸的色譜峰與樣品中的雜質(zhì)峰可以達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)按照阿魏酸峰計(jì)算大于3000[3]。6批當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.2 Content determination results of samples(%,n=3)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

[4-6]，對(duì)流動(dòng)相的選擇考察了甲醇-0.1%磷酸溶液的不同比例（25∶75，30∶70，45∶55），但是分離效果均不理想，樣品峰與雜質(zhì)峰分離不完全，因此，本文中最后采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液（25∶75）作為檢測(cè)當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸的含量測(cè)定法，分離效果滿意，保留時(shí)間適中。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

選擇檢查波長(zhǎng)時(shí)，筆者取樣品在220～400 nm處進(jìn)行掃描，結(jié)果表明阿魏酸在321 nm處有最大吸收峰，且干擾條件少，故選擇321 nm作為樣品中阿魏酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。

當(dāng)歸養(yǎng)血丸制劑中以當(dāng)歸的藥材細(xì)粉入藥，《中國(guó)藥典》2005年版一部中當(dāng)歸項(xiàng)下阿魏酸的含量限度為0.05%[7]，由測(cè)定的6批樣品中阿魏酸的含量，以《中國(guó)藥典》2005年版當(dāng)歸藥材含量限度為依據(jù)[8]，當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量不得低于0.035 mg/g。

綜上所述，本文建立了高效液相色譜法測(cè)定當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量，方法的重現(xiàn)性、分離度等均符合規(guī)定，測(cè)定的方法穩(wěn)定，經(jīng)過對(duì)樣品各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)的反復(fù)考察結(jié)果，其專屬性較強(qiáng)，可用于當(dāng)歸養(yǎng)血丸的質(zhì)量控制，具有可行性。

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